Приора акб полярность: Какой аккумулятор на приоре, полярность, производители цена

И в 5t88, и в 3ddu распределение энергетических членов подразумевает, что энергия десольватации всегда является дорогостоящей (рис. 2d, e; дополнительные таблицы 8, 9, 10, 11), а энергия моста, в свою очередь, (рис. 2f, g ; Дополнительные таблицы 8, 9, 10, 11) всегда благоприятно.Здесь фоновый член представляет собой комбинацию более благоприятных и менее неблагоприятных кандидатов (рис. 2h, i; дополнительные таблицы 8, 9, 10, 11). Сравнивая эти энергетические термины между 5t88 (дополнительные таблицы 9, 11) и 3ddu (дополнительные таблицы 8, 10), мы видим некоторые интересные наблюдения. Во-первых, хотя в случае 5t88 (рис. 2e) частота кандидатов с низкой стоимостью десольватации (≤ 20 ккал / моль) выше; в случае 3ddu (рис. 2г) такое наблюдение с энергией десольватации> 20 ккал / моль также верно.Во-вторых, что интересно, в случае 5t88 частота кандидатов в благоприятный мостик намного выше, чем у 3ddu (рис. 2f, g). В целом, в случае 5t88 энергия десольватации на 62,3 ккал / моль более неблагоприятна, чем у 3ddu. В то же время в 5t88 энергия моста на -119,6 ккал / моль более выгодна, чем в 3ddu (дополнительная таблица S7). Это означает, что из этих двух энергетических терминов в 5t88 избыточный выигрыш в полезной энергии составляет -57,2 ккал / моль. Энергии десольватации и мостов имеют тенденцию нейтрализовать влияние друг друга, поэтому такой большой выигрыш в энергии (-57.2 ккал / моль белка) из этих двух терминов очень важен для 5t88 с точки зрения его термостабильности. Наряду с этим, 5t88 дополнительно получил — 19,4 ккал / моль дополнительной энергии от ΔΔG _bac с учетом 3ddu (дополнительная таблица S7).

Рис. 2j, k были представлены для понимания этого выигрыша в терминах энергии в нормализованном масштабе (на 100 остатков белка) для солевых мостиков IP и NU в 5t88 относительно 3ddu. Хотя относительные приросты IP 5t88 и чистой энергии NU почти равны (~ — 8.0 ккал / моль на 100 остатков белка), они не были достигнуты таким же образом. В случае IP (рис. 2j) относительный избыток неблагоприятной энергии десольватации (красная полоса) был смягчен в основном за счет благоприятной энергии моста. В случае NU (рис. 2k), с одной стороны, энергия десольватации незначительна, с другой стороны, влияние благоприятной фоновой энергии больше. Оказывается, электростатическая прочность каждого из солевых мостиков 5t88 на ~ — 1.04 ккал / моль больше, чем у 3ddu (рис.2л). Таким образом, мы видим, что в первом больше не только количество соляных мостиков; в этом случае электростатическая сила на солевой мостик также больше. Здесь увеличение прочности каждого соляного моста кажется основной стратегией. В этом контексте следует отметить, что количество направленных на поверхность солевых мостиков в 5t88 (66%) выше, чем у 3ddu (Таблица 1), что снижает энергию десольватации ³⁶ . Здесь также упоминается, что, хотя каждая пара солевых мостиков с одинаковой вероятностью вносит вклад в стабильность белка ⁴⁶ , предпочтительные пары, которые вносят больший вклад в стабильность ⁴⁷ и способствуют спирали ⁴⁸ (т.е.е. KE и RE и в некоторой степени RD) преобладают в популяции солевых мостиков 5t88 (рис. 1f, g). В целом, по мере увеличения количества солевых мостиков электростатическая сила солевого мостика PfP превышает таковую HuP, что указывает на внутреннюю стратегию.

HuP и энергетика микросреды и бинарные свойства солевого мостика PfP

Длина 3ddu HuP на 94 остатка больше, чем 5t88 PfP (дополнительный рисунок S1), но это 22,2% (для IP) и 21,7% (для NU) от заряженные остатки участвуют в солевом мостике (таблица 1).В случае 5t88, с другой стороны, 28,5% (в виде IP) и 27,0% (в виде NU) заряженных остатков участвуют в солевом мостике (таблица 1). Остальная часть заряженного остатка, не являющегося солевым мостиком (nSBME), остается в виде изолированного заряда в белке. В дополнение к ним другие типы остатков (PO, PG, HB), IPME, NUME также участвуют в качестве ME. На рис. 3а представлены высокостабильные (-30,4 ккал / моль) типичное ядро ​​(ASAav 8,14 Å ² ) и сетчатый солевой мостик ME 5t88. Среда МЭ состоит из изолированных заряженных (красный, кислый и синий, основной), полярных (желтый) и гидрофобных (серый) остатков (рис.3а). Хотя количество гидрофильных остатков (заряженных и полярных) в ME велико, большинство из них расположены в ядре вместе с ядром солевого мостика (рис. 3b). Интересно, что две трети МЭ находится в спирали (рис. 3в). Видно, что взаимодействие кислотных остатков несколько неблагоприятно, но для всех других типов ME-остатков (BS, PO, HB) энергия взаимодействия благоприятна (рис. 3d).

5t88, чем микросреда солевого мостика 3ddu, его класс остатков, распределение и бинарные детали являются более многообещающими.Типичный ME ( a , остатки: кислотный, красный; основной, синий; полярный, желтый; гидрофобный, серый; остатки ядра имеют сферу с кольцом; энергия взаимодействия показана тем же цветом, что и остаток с вторичной структурой, т.е. H — спираль; C — клубок) соляного мостика и его расположение ( b ), вторичная структура ( c ) и энергия взаимодействия ( d ). ME присутствует с единицей NU (ASAav 8,14 Å ² и чистая стабильность — 30,4 ккал / моль). Распределение стабильной (черный) и нестабильной (красный) ME-популяции 5t88 ( e ) и 3ddu ( f ) (популяция IP и NU вместе).Точно так же распределение 5t88 ( г, ) и 3ddu ( h ) захороненной (черный) и экспонированной (красный) ME-популяции (IP- и NU-популяция вместе). Нормализованная частота классов остатков (заряженный, CR; полярный PO; Pro и Glu PG и гидрофобный, HB) 5t88 (черная полоса) и 3ddu (зеленая полоса) ME-популяции ( и ). Относительная частота заряженных ME-остатков в 5t88 относительно 3ddu ( j ). ME-остатки IPME, которые действуют как микроокружение только IP, NUME-ME-остатки, которые действуют как микроокружение только NU, SBnME-остатки SB, которые не действуют как микроокружение, ME-остатки nSBME, которые действуют как микроокружение, но не участвуют в солевом мостике и заряженных остатках, которые не участвуют ни в микросреде, ни в образовании солевого мостика.Относительная частота ME-остатков 5t88 относительно 3ddu ( k ). Относительное предпочтение вторичной структуры ME-остатков 5t88 по сравнению с 3ddu (-1).

В целом, благоприятная популяция ME 5t88 (616 остатков) намного выше, чем у 3ddu (707 остатков) (рис. 3e, f). Однако основная ME-популяция 5t88 меньше, чем у 3ddu (рис. 3g, h). Заряженные остатки (CR), за которыми следуют полярные (PO), PG и гидрофобные (HB) (рис. 3i), составляют большую часть этой общей ME-популяции.Заряженные остатки можно в общих чертах разделить на пять различных категорий, таких как IPME, NUME, SBnME, nSBME и nSBnME. Население первых трех категорий выше на 5t88, чем у 3ddu (рис. 3j). Хотя полярный класс меньше в последовательности 5t88 по сравнению с 3ddu (Fig. 1c), с точки зрения ME-популяции, это не верно для всех этих остатков (Fig. 3k). ME-популяция 5t88 выше по спирали и цепи по сравнению с 3ddu (рис. 3l). Эти особенности ME-популяции 5t88 и 3ddu подробно показаны в таблицах 2 и 3 в количественной форме (см. Ниже).

ME была извлечена с использованием метода APBS. ⁴⁵ либо при условиях по умолчанию, либо при умеренных параметрах (дополнительная таблица 6), чтобы избежать нелинейности, связанной с PBE. В случае 5t88 и 3ddu энергетические и бинарные детали этих ME-остатков описаны в таблице 2 для 5t88 и в таблице 3 для 3ddu.Кроме того, специфичные для остатков детали ME-энергии и бинарных свойств также показаны в дополнительных таблицах (дополнительная таблица S12 для 5t88 и дополнительная таблица S13 для 3ddu). Здесь следует отметить, что взаимодействие между ME-кандидатом и партнером по солевому мостику (кислотным или основным) очень сложное, перекрывающееся, взаимосвязанное и сложное, которое имеет место в детальном трехмерном пространстве белка. Здесь стоит отметить многие моменты. Во-первых, есть три категории ME-остатков для каждого класса остатков (CR, PO, PG и HB), такие как ME только для солевого моста IP, ME только для солевого моста NU и ME как для IP, так и для NU. виды соляных мостиков.Партнер солевого мостика IP или NU (кислотный или основной) может действовать как ME-кандидат для других типов IP или NU солевого мостика. Во-вторых, хотя остатки в классах, отличных от заряженного класса, всегда относятся к типу несолевого мостика, они могут участвовать в качестве ME-кандидатов в различных солевых мостиках IP и NU перекрывающимся и исчерпывающим образом (дополнительная таблица S12 для 5t88 и дополнительная таблица S13 для 3ddu). В-третьих, хотя количество остатков в 5t88 ниже (616 остатков), чем у 3ddu (707 остатков), общее количество остатков в ME почти такое же i.е. 213 и 217 соответственно. В первом случае число больше в ME-остатке партнера солевого мостика (IPME и NUME), но во втором случае число больше в ME-остатке природы nSBME. В-четвертых, в 5t88 большее количество ME-остатков располагается на поверхности (таблица 2; рис. 3g), в отличие от 3ddu, большее количество ME-остатков присутствует в ядре (таблица 3; рис. . 3h). В то время как большинство ME-остатков 5t88 находятся в спиралях и цепях (Таблица 2; Рис. 3l), ME-остатки в 3ddu имеют больше в спиралях (Таблица 3).В-пятых, в целом энергетический вклад ME-остатка в 5t88 намного выше, чем у 3ddu (~ — 88 кДж / моль) (Таблицы 2, 3). В-шестых, интересно, поскольку белки содержат несколько солевых мостиков, уникальные ME-остатки действуют как ME-остатки для различных солевых мостиков. Следовательно, использованное время (TU) ME-остатка намного выше, чем его уникальная частота (Таблицы 2, 3). Возникновение этого повторного использования ME-остатков, по-видимому, является важным событием в укладке и стабильности белка.

Замена остатков гомологичного микроокружения и мутация in silico

Чистая стабильность 5t88 составляет -78.На 2 ккал / моль выгоднее, чем у 3дду. По мере того, как количество и сила солевых мостиков увеличиваются, увеличивается и вклад МЭ-энергии, специфичной для остатков. МЭ-энергия у 5t88 на ~ — 90 кДж / моль более выгодна, чем у 3ddu. Как 5Т88 добился последнего? Благоприятные и неблагоприятные ME-остатки расположены в ядре и на поверхности обоих белков (рис. 4a – h). Во всех этих благоприятных или неблагоприятных случаях количество ME-кандидатов сильно коррелирует с их ME-энергией. Примечательно, что в случае 5t88 вклад благоприятной ME-популяции ядра (CO, ST) эквивалентен вкладу 3ddu (разница ~ 1.0 кДж / моль), но в случае поверхности (SU, ST) она больше (разница ~ — 20 кДж / моль), чем у последней (рис. 4a – d, i). Опять же, хотя неблагоприятная МЭ-энергия немного выше (8,0 кДж / моль) в случае ядра (CO, UST) (рис. 4e, f, i), из-за низкой неблагоприятной ME-заселенности на поверхности (SU, UST) вклад энергии 5t88 составляет -78,0 кДж / моль по сравнению с 3ddu (рис. 4g – i). Это означает, что как неблагоприятная ME-популяция была удалена из ядра, так и благоприятная ME-популяция рекрутировалась на поверхности.

Распределение в ядре и поверхности ME-остатков 5t88 и 3ddu, а также их корреляция, энергия взаимодействия и мутагенез. У 3ddu (черный кружок) стабильная сердцевина (CO, ST) ( a ), стабильная поверхность (SU, ST) ( c ), нестабильная сердцевина (CO, UST) ( e ), нестабильная поверхность ( g ) ) (SU, UST) ME-кандидаты сравниваются со стабильностью ядра ( b ), стабильностью ядра ( d ), нестабильностью ядра ( f ), нестабильностью поверхности ( h ) ME- кандидаты соответственно.Сравнение 5t88 (черная полоса) и 3ddu (зеленая полоса)) ядра (CO) и поверхности (SU), стабильных (ST) и нестабильных (UST) ME-кандидатов ( и ). Особенно в выбранных ME-кандидатах ядра (синий) и некоторых поверхностей (желтый), которые получены в результате последовательного гомологичного замещения и которые благоприятны для 5t88 (черная полоса) в отношении 3ddu (зеленая полоса) ( j ) . Солевой мостик и ME-остатки дикого ( k ) и мутантного ( l ) белка 3ddu, где h594 (синий) был мутирован с помощью E494 (красный).Компоненты Wild (зеленая полоса) и мутанта (черная полоса) 3ddu и чистая энергия ( m ). По сравнению с PfP, некоторые из гомологичных неблагоприятных ME-остатков HuP и их бинарные детали ( n ). Кислотный (красный), основной (синий), полярный (желтый) и гидрофобный (серый) ME-остатки солевого мостика, D641-H680 ( o ). Здесь остатки, которые используются для кумулятивных замен, показаны красными полосками. Энергетические условия мутанта (черный) и HuP дикого типа ( p ).Аналогичное представление остатков ME ( q ) и энергетических терминов ( r ) показано для солевого мостика K172-D642.

Было представлено несколько случаев (рис. 4j) для проверки увеличения ME-энергии в 5t88 по сравнению с 3ddu из-за гомологичного замещения (дополнительный рисунок S1) в последовательности и изменения местоположения (ядро и поверхность). В большинстве случаев наблюдается увеличение ME-энергии в 5t88 для замены аминокислоты и изменения местоположения, то есть перехода ядра (синий) к поверхности (желтый) или наоборот по отношению к ME-остатку 3ddu (зеленый).Кроме того, прирост энергии виден в 5t88, хотя о местонахождении и замещении ничего не говорится. Вдохновленные этим внутренним методом увеличения ME-энергии в термофильном 5t88, мы исследуем эффект замещения неблагоприятного ME-остатка (h594E) 3ddu методом in silico (рис. 4k, l). Примечательно, что в то время как фон и чистая энергия солевого мостика в белках дикого типа неблагоприятны, в мутантных белках он очень благоприятен (рис. 4m).

В термостабильности белка важность определенных гомологичных заряженных и полярных остатков, отличных от солевых мостиков, огромна ^12,27,28,29 .Здесь мы используем свойство внутренней последовательности PfP для увеличения термостабильности HuP (рис. 4n – r). Остатки D641 и D642 HuP консервативны, как и остатки PfP. В отличие от PfP, в HuP, помимо микроокружения, эти остатки также участвуют в IP-типах солевых мостиков (Fig. 4n). Примечательно, что они крайне неблагоприятны как остатки микросреды (рис. 4n; дополнительная таблица S13). Опять же из-за неблагоприятного воздействия некоторых остатков микросреды чистая стабильность солевого мостика, K172-D642 (крайне неблагоприятные ME-остатки, R170, H593, D641), является неблагоприятной, а стабильность H680-D641 (крайне неблагоприятная ME- остатки, E201, D639, D642) лишь незначительно стабильна.Это означает, что эти два остатка действуют как неблагоприятные ME-остатки в микроокружении друг друга. В случае PfP эти два остатка (т.е. D560 и D561) не участвуют в солевом мостике. Тот, у которого меньше всего повторений, то есть D561, направлен на поверхность (рис. 4n). Опять же, даже несмотря на то, что R560 неблагоприятен, он в 6–7 раз меньше, чем у D641 (рис. 4n; дополнительные таблицы S12 и S13). Каковы индивидуальные и совокупные эффекты наиболее неблагоприятных ME-остатков (упомянутых выше) в каждом из этих двух солевых мостиков по сравнению с PfP? Эти результаты показаны на рис.4o – r. Замены гомологичных ME-остатков HuP выполняются так же, как и в последовательности PfP (фиг. 4n). Благоприятные исходы получены для индивидуальных замен (данные не показаны), которые в 8–14 раз выше в случае кумулятивных мутаций (рис. 4p, r). Поскольку эти остатки используются многократно как на солевом мостике, так и на ME, мы рассмотрели глобальный эффект кумулятивных мутантов. Видно, что общая электростатическая стабильность этих кумулятивно мутантных белков выше, чем HuP дикого типа.

Нацеленность на сосудисто-специфическую фосфатазу PTPRB защищает от потери ганглиозных клеток сетчатки в доклинической модели глаукомы

Для повышения уровня фосфорилирования TEK in vivo мы использовали нокаут-репортерный аллель Ptprb ^NLS-LacZ (Bäumer et al., 2006) для удаления единственного аллеля гена Ptprb . Эта конструкция включает кДНК β-галактозидазы, помеченную сигналом ядерной локализации, вместо первого экзона Ptprb , предотвращая продукцию белка PTPRB.Как описано ранее, гетерозиготные мыши Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} рождаются нормально (Bäumer et al., 2006), хотя экспрессия PTPRB была снижена примерно на 50% (рисунок 1A, несекретные изображения представлены на рисунке 1 — рисунок приложение 1). Точно так же гетерозиготность Tek привела к примерно 50% снижению белка TEK, обнаруженного в лизате легких (рис. 1A). Снижение количества фосфатаз оказало прямое влияние на активацию TEK, и мыши Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} показали примерно 118% увеличение фосфорилированного TEK при измерении в легочной ткани с помощью анализа иммунопреципитации (рис. 1B, несекретные изображения представлены на рис. 1 — приложение к рисунку 2), подтверждая нашу гипотезу о том, что изменения в экспрессии PTPRB будут иметь прямое влияние на фосфорилирование TEK.

Делеция одного аллеля

( A ) Вестерн-блот лизата легких из контроля P5, Tek ^+/- , Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} и Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} мышей выявили 50% снижение экспрессии PTPRB в Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} (гетерозиготный) и Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} мышей.Сходным образом экспрессия TEK была снижена примерно на 50% у Tek ^+/- и Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} мышей. ( B ) Иммунопреципитация лизатов легких взрослых контрольных животных и Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} с использованием антитела против TEK с последующим вестерн-блоттингом с антителом против фосфотирозина выявила заметное повышение фосфорилирования TEK в Ptprb NLS-LacZ / WT животных по сравнению с контрольными однопометниками.Горизонтальные линии показывают средние значения населения. * p <0,05, *** p <0,001 согласно t-критерию Стьюдента.

Обнаружение, что Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} гаплонедостаточные мыши демонстрируют заметно повышенное фосфорилирование TEK, предполагает, что эти животные могут стать мощным инструментом для изучения влияния блокады PTPRB на развитие SC в контексте сниженной передачи сигналов TEK. Таким образом, мы скрестили мышей, несущих аллель Ptprb ^NLS-LacZ , с ранее описанной мышиной моделью гетерозиготности Tek , создав конститутивную модель Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} двойная гаплонедостаточность.У взрослых мышей Tek с гаплонедостаточностью обнаруживается гипоморфный SC, недостаточный для нормального AHO, что приводит к умеренному повышению ВГД (Souma et al., 2016). Чтобы проверить нашу гипотезу, что ~ 50% снижение активности PTPRB может предотвратить фенотип глаукомы у мышей Tek ^+/- без необходимости увеличения доступности лиганда, Tek ^+/- ; Ptprb ^{Получали двойных гетерозиготных мышей NLS-LacZ / WT} и собирали энуклеированные глаза.После фиксации глаза были подготовлены для иммуноокрашивания целиком и визуализированы с помощью конфокальной микроскопии. В соответствии с предыдущими результатами (Souma et al., 2016), анализ CD31-положительной области SC выявил фенотип гипоморфного канала у взрослых гетерозиготных мышей Tek по сравнению с контрольными однопометниками (контроль: 29,974 ± 2145, Tek ^{+ / —} : 17,457 ± 1040 мкм ² / 20x поле; Рисунок 2A). Этот фенотип был аннулирован удалением единственного аллеля Ptprb в Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} животных с нормальной площадью SC ( Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} : 23,848 ± 1574 мкм ^{2 902/202).Важно отметить, что, несмотря на повышенную активацию TEK, Ptprb NLS-LacZ / WT животных показали нормальный SC ( Ptprb NLS-LacZ / WT : 28,175 ± 1668 мкм 2 / 20x поле), что свидетельствует о снижении поля PTPR. функция хорошо переносится во время развития СК при отсутствии других мутаций.}

Передача сигналов TEK имеет дозозависимый эффект на площадь и развитие канала Шлемма (SC).

( A ) Конфокальная микроскопия всех глаз выявила уменьшенную площадь CD31 + SC у взрослых мышей Tek ^+/- гаплонедостаточных. Этот фенотип был притуплен в Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} двойных гетерозиготных животных, что подтверждает важность активации TEK в развитии канала. Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} гетерозиготные контроли имели нормальную площадь SC (n = 8 WT, 12 Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} , 11 Tek ^+/- и 11 902 9021 Tek +/- и 11 902 9021 Tek +/- и 11 902 9021 Tek / — ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} мышей).Показанные 20-кратные поля представляют площадь 65 536 мкм ² . Изображения были захвачены в виде 10-кадровых Z-стеков с размером шага 1,67 мкм и отверстием 1,2 единицы Эйри, и показаны как проекции максимальной интенсивности. ( B , количественно в C ) На 5-й день постнатального развития (P5) конфокальная микроскопия развивающихся SC в целых образцах глаза выявила снижение количества пролиферирующих Ki-67-позитивных SC EC (Ki67-PROX1 двойных позитивных клеток) в Tek гаплонедостаточных животных по сравнению с однопометниками WT или Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} контроля.Нормальная пролиферация наблюдалась у Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} животных. ( D ) По сравнению с контрольными мышами Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} , экспрессия PROX1 была снижена в Tek ^+/- глазах у однопометников. Экспрессия была нормальной в Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} двойные гетерозиготы. n = 8 (WT), 4 ( Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} ), 8 ( Tek ^+/- ) и 5 ​​( Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS- LacZ / WT} ) Показаны проекции максимальной интенсивности из 8-кадровых конфокальных Z-стеков, снятых с помощью объектива с 20-кратным увеличением, размером шага 1 мкм и точечного отверстия 1.2 единицы Эйри. Норма. AFU: нормализованные, произвольные единицы флуоресценции за вычетом фона. ( E ) По сравнению с контролем и Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} однопометников конфокальный анализ СК взрослых выявил заметное увеличение количества фокальных извилин и сужений в глазах Tek ^+/- и Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} мышей. N = 4 (WT), 7 ( Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} ), 5 ( Tek ^+/- ) и 6 ( Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS- LacZ / WT} ).Горизонтальные линии показывают средние значения населения. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, как определено с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующей поправкой Бонферрони.

Гаплонедостаточность развития Tek и Ptprb оказала явное влияние на область SC у взрослых в нашей модели. Чтобы определить, был ли этот фенотип обусловлен измененной пролиферацией эндотелиальных клеток (ЭК) SC, мы затем проанализировали глаза, собранные на P5, когда развитие SC продолжается. В глазах Tek ^+/- мы наблюдали заметное снижение доли ЭК PROX1 + SC, которые также были положительными для Ki-67 (контроль: 0.302 ± 0,022, Tek ^+/- : 0,214 ± 0,016), предполагая, что фенотип гипоморфного канала у этих животных может быть обусловлен сниженной пролиферацией во время развития канала (Рисунок 2B, количественно определено в C ). Поразительно, что нормальная пролиферация клеток PROX1 + SC наблюдалась в Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} мыши ( Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} : 0,345 ± 0,039), обеспечивая потенциальный механизм наблюдаемых эффектов на зону канала у взрослых .Подобный эффект наблюдался на экспрессии PROX1, которая резко снижалась в SC глаз Tek ^+/- на P5 и казалась нормальной в глазах Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} однопометники (Норм. AFU: Контроль: 1,0 ± 0,12, Tek ^+/- : 0,49 ± 0,07, Tek ^+/- ; Ptprb LacZ / WT : 0,82 ± 0,065, рисунок 2D).

В дополнение к уменьшенной площади, SC Tek ^+/- характеризуются очаговым истончением и извилинами, которых нет у однопометников WT (Souma et al., 2016) (Рисунок 2E). Интересно, что хотя гаплонедостаточность Ptprb приводила к повышенной пролиферации и расширению площади канала у Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} животных, эти очаговые дефекты все еще наблюдались — это указывает на то, что направленная передача сигналов может играть роль в формировании собственно канала, что не может быть воспроизведено неспецифической активацией TEK.

Затем мы исследовали влияние измененной площади SC в Tek ^+/- и Tek ^+/- ; Ptprb ^{Мыши NLS-LacZ / WT} с гомеостазом водянистой влаги.Было обнаружено, что у гетерозиготных мышей Tek на беспородном фоне повышенное ВГД в возрасте 30 недель (рис. 3A, контроль: 13,7 ± 0,23, Tek ^+/- 18,15 ± 0,33 мм рт. Ст.). В соответствии с наблюдениями за морфологией SC, в то время как мыши Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} имели нормальное ВГД (13,81 ± 0,82 мм рт. гипертония, связанная с гаплонедостаточностью Tek , несмотря на наличие очаговых морфологических дефектов ( Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} ВГД: 14.92 ± 0,31 мм рт. Ст.). Чтобы подтвердить влияние снижения ВГД, вызванного Ptprb ^NLS-LacZ , на сетчатку, мы подсчитали BRN3B-положительные ганглиозные клетки в дополнительной когорте мышей в возрасте 19 недель (рис. 3В). В то время как у гетерозиготных мышей Tek обнаружено заметное снижение RGC, этой потери не произошло у Tek ^{+ /} ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} мышей.

( A ) Повышенное внутриглазное давление (ВГД) наблюдалось у мышей Tek ^+/- гаплонедостаточных в возрасте 30 недель при измерении с помощью тонографии отскока. Как показано на рисунке 2, этот фенотип был предотвращен у Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} двойных гетерозиготных животных, подтверждающих важность активации TEK в гомеостазе ВГД (n = 6 WT, 14 Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} , 12 Tek + и 14 мышей Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} ).( B ) Окрашивание BRN3B в плоских держателях сетчатки из второй группы мышей выявило потерю ганглиозных клеток сетчатки к 19 неделе у мышей Tek ^+/- . Однопомет Тек ^+/- ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} животных были защищены, что коррелировало с наблюдаемым сниженным ВГД (n = 4 WT, 4 Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} , 3 Tek ^+/- и 4 Tek ^+/- ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} мышей).Горизонтальные линии показывают средние значения населения. * p <0,05, *** p <0,001, как определено с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующей поправкой Бонферрони.

TEK имеет решающее значение для ангиогенеза сетчатки, и чтобы исключить возможность того, что сосудистые дефекты и последующая ишемия были ответственны за потерю RGC у мышей Tek ^+/- , мы исследовали морфологию сосудов у наших животных. Сначала мы исследовали сетчатку, собранную на P5, когда продолжается развитие поверхностной сосудистой сети.В этот момент окрашивание CD31 показало нормальный прогресс ангиогенного фронта прорастания в Tek ^+/- , Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} и Tek ^{+ /} ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} мышей по сравнению с контрольными однопометными мышами (фигура 3 — приложение к рисунку 1A). На P20, когда развитие зрелой сосудистой сети сетчатки завершено, мы наблюдали нормальное формирование паттерна во всех трех сосудистых слоях сетчатки у мышей всех генотипов (Рисунок 3 — приложение к рисунку 1B).К этому моменту гиалоидные сосуды не наблюдались у животных любого генотипа. Взятые вместе, эти данные позволяют предположить, что снижение уровня ВГД у Tek ^{+ /} ; Ptprb ^{NLS-LacZ / WT} животных, вероятно, оказали прямое влияние на патогенез глаукомы в нашей модели, и что ишемия сетчатки вряд ли может объяснить потерю RGC, наблюдаемую у мышей с гаплонедостаточностью Tek.

Должен ли я быть AMG или AKB?

Я ненавижу начинать статью с абзаца, пытающегося оправдать или объяснить свои полномочия как болельщика «Арсенала», поскольку я один из тех, кто принимает любого, кто поддерживает мой клуб, как желанного болельщика.Однако в наши дни это кажется нормой: да: я болею за «Арсенал» с 3 лет и несколько лет держал сезонный билет как в Highbury, так и в E ****** s, а также когда я жил на севере, я все еще ездил на большинство домашних игр, а также на все выездные игры против клубов, базирующихся на моей базе в Йоркшире. С тех пор, как несколько лет назад я переехал работать в Канаду, я по-прежнему посещал 5-8 живых матчей каждый сезон. Если этого недостаточно, кого это волнует?

Похоже, что по той или иной причине поддержка «Арсенала» теперь стала делом одного из менеджеров, и нам больше не разрешают быть просто ФАНАТАМИ «АРСЕНАЛА».На этот сайт было бесчисленное количество нападок на то, чтобы сидеть на заборе или отклоняться от одной стороны в дебатах о том, избавляться от Венгера или нет. Что ж, у меня для всех вас новости: АРСЕНАЛ — это клуб, который существовал на осле за много лет до Венгера, и нравится нам это или нет, некоторым из нас разрешено быть ФАНАТАМИ АРСЕНАЛА, и тем самым мы счастливы, когда клуб побеждает и опустошен, когда мы проигрываем.

Давайте быстро оглянемся на «Арсенал» в сезоне 2011/2012: мы плохо начали сезон (некоторые говорили, что это худшее начало сезона премьер-лиги для нас), затем один из наших игроков почти побил рекорд по наибольшему количеству забитых мячей. календарный год.Мы героически обыграли наших главных соперников («Шпоры»), а затем капитулировали перед клубами ниже в лиге. Затем мы неожиданно продолжили серию из 7 побед, а затем отказались от игры против QPR. Разве это не похоже на сезон взлетов и падений? ТАК, КАК И ПОЧЕМУ ЛЮБОЙ ФАНАТ-ЧЕЛОВЕК не испытывал в этом сезоне взлетов и падений в эмоциях? Почему кто-то должен быть съеден такой ненавистью к одному человеку (ВЕНГЕР) до такой степени, что мы все должны выступить и признать, что мы против Венгера или за Венгера? МЫ — НЕ ФАНАТЫ АРСЕНАЛА, вне зависимости от того, кем был менеджер?

В начале сезона мы все молились, чтобы мы не оказались в середине таблицы, затем мы сделали справедливый ход в Кубке CC и FA, и некоторые говорили, что победа в кубке плюс попадание в топ-4 было бы здорово.Потом у нас случился знакомый нам коллапс, и мы оказались в игре только за место в лиге чемпионов. Некоторые говорят, что нам очень повезло оказаться там, где мы сейчас, судя по старту, который мы сделали в сезоне. В перерывах между этим «шпоры» начали играть в очень привлекательный футбол и были на световые годы впереди нас по набранным очкам, и внезапно появился король Гарри, который, по всей видимости, является лучшим, что когда-либо случалось с британским футболом. За этим последовало несколько сообщений о более низкой заработной плате Тоттенхэма, об отличном менеджменте Гарри и его способности получать от своих игроков больше, и у нас на сайте появилось больше публикаций фанатов Шпор, чем когда-либо, а затем произошел всплеск, внезапно Арсенал восполнил пробел. и теперь, когда больше не о чем говорить, все дело в том, кто лучший фанат: ненавистник Венгера или любитель Венгера? Какая жалость! Если фанат «Арсенала» превратился в него, то клубу действительно нужно оживить.

Да, я ранее призывал к отъезду Арсена (с высоко поднятой головой) в конце сезона, и по ходу сезона я пересмотрел свою позицию, как нормальный человек, и задействовал несколько других факторов, например, кто его замена будет? Есть ли у нас правление, способное привлечь или привлечь надежную замену? Должны ли проблески обещания, показанные такими, как Бык и Кос, означать, что Арсену нужно дать еще немного времени, чтобы, возможно, оживить клуб? Эти и несколько других факторов — это те факторы, которые обычные фанаты учитывают в наших взлетах и ​​падениях, и, поскольку у нас нет хрустального шара, никто не знает, как все обернется.Итак, НЕТ, мне не нужно быть AMG или AKB, и мне не нужно слепо придерживаться единого мнения или взгляда, просто чтобы ассоциировать с той или иной стороной. Я буду продолжать максимально использовать имеющуюся у нас информацию (выступления, стремление привлечь новых игроков и т. Д.), Предоставляя комментарии или мнения по другим комментариям, которые будут сочтены уместными.

Давай, артиллеристы! Давайте хотя бы закрепим 3-е место и посмотрим, что принесет 2012 год !!!!!

SONY CXD2411AR

Загрузить