Вэс недостатки и преимущества: Ветром надуло: какие преимущества и недостатки у энергии ветра

История ветряной энергии

Не только современные люди обнаружили удивительные свойства ветра, направив их на получение электроэнергии и развитии прочих благ. В третьем тысячелетии до нашей эры люди уже научились успешно использовать силу ветра. Чуть позже человеку удалось создать устройство, при помощи которого удавалось приводить в порядок земли, осушать заболоченные местности.

Немного позже появились первые ветряные мельницы на территории Египта, которые на протяжении многих лет позволяли человеку получать муку из зерновых культур.

Ветер позволял китайцам откачивать воду с рисовых полей. Для этого на полях были установлены специальные устройства с лопастями, которые приходили во вращательное движение благодаря потокам ветра.

Однако Европа продолжительное время не уделяла должного внимания ветряным технологиям, поэтому на европейском континенте они стали распространяться только спустя несколько веков.

Секвенирование всего генома (WGS) по сравнению с секвенированием всего экзома (WES)

«Что выбрать для моего проекта — секвенирование всего генома (WGS) или всего экзома (WES)?» это настолько часто задаваемый вопрос во время консультации по Genohub, мы подумали, что было бы полезно ответить на него здесь. Обладая неограниченными ресурсами и временем, WGS — явный победитель, поскольку он позволяет вам исследовать однонуклеотидные варианты (SNV), инделки, структурные варианты (SV) и варианты числа копий (CNV) как в ~ 1% части генома, которая кодирует белковые последовательности и ~ 99% остальных некодирующих последовательностей.WES по-прежнему стоит намного меньше, чем WGS, что позволяет исследователям увеличивать количество выборок, что является важным фактором для крупных популяционных исследований. Однако у WES есть свои ограничения. Ниже мы выделили преимущества WGS по сравнению с WES и описали реальный пример того, как кто-то заказывает эти услуги через Genohub.

Преимущества секвенирования всего генома

1. Позволяет исследовать SNV, инделки, SV и CNV в кодирующих и некодирующих областях генома. WES не включает регуляторные области, такие как промоторы и энхансеры.
2. WGS имеет более надежное покрытие последовательности. Различия в эффективности гибридизации зондов захвата WES могут привести к участкам генома с небольшим охватом или без него.
3. Равномерность покрытия с WGS превосходит WES. Области генома с низкой сложностью последовательности ограничивают возможность разработки полезных приманок для захвата WES, что приводит к эффектам захвата вне цели.
ПЦР-амплификация
4. не требуется во время подготовки библиотеки, что снижает вероятность смещения GC.WES часто требует ПЦР-амплификации, так как объем вводимого количества, необходимого для захвата, обычно составляет ~ 1 мкг ДНК.
5. Длина чтения секвенирования не является ограничением для WGS. Большинство зондов-мишеней для exome-seq имеют длину менее 120 нуклеотидов, что делает бессмысленным секвенирование с использованием большей длины чтения.
6. Требуется более низкая средняя глубина считывания для достижения такого же уровня покрытия, как у WES.
7. WGS не страдает систематической ошибкой ссылок. Зонды захвата WES имеют тенденцию преимущественно обогащать референсные аллели в гетерозиготных сайтах, вызывая ложноотрицательные вызовы SNV.
8. WGS более универсален. Если вы секвенируете не человеческий вид, а другой вид, ваш выбор для секвенирования экзома довольно ограничен.

Преимущества секвенирования всего экзома

1. WES нацелен на белковые кодирующие области, поэтому считывания составляют менее 2% генома. Это снижает стоимость секвенирования целевой области на большой глубине и снижает затраты на хранение и анализ.
2. Снижение затрат делает возможным увеличение количества образцов для секвенирования, что позволяет проводить сравнения на основе больших популяций.

Большинство функционально связанных вариантов заболевания могут быть обнаружены на глубине между 100-120x (1), что определенно является оправданием затрат на секвенирование экзома. Сегодня на Genohub, если вы хотите выполнить секвенирование всего человеческого генома с глубиной ~ 35X, стоимость составит примерно 1700 долларов за образец. Если бы вы запросили услуги по секвенированию экзома человека со 100-кратным охватом, используя целевую область 62 Мб, ваши затраты составили бы 550 долларов за образец. Обе эти цены включают подготовку библиотеки. Таким образом, с точки зрения производства данных WES по-прежнему значительно дешевле WGS.Важно отметить, что сюда не входят расходы на хранение и анализ данных, которые также могут быть немного выше при секвенировании всего генома.

Также важно помнить, что глубина — это еще не все. Чем лучше у вас единообразие чтения и дыхание охвата, тем выше вероятность того, что вы действительно обнаружите мутации de novo и вызовете их. И это главная цель: если вы не можете вызвать SNP или INDEL с высокой чувствительностью и точностью, то запуски секвенирования на самой глубокой глубине бесполезны.

В заключение, полногеномное секвенирование обычно обеспечивает лучшую однородность и сбалансированное соотношение аллелей. В то время как большая глубина exome-seq может соответствовать этому, достаточная отображаемая глубина или обнаружение вариантов в определенных регионах может никогда не достичь качества WGS из-за ошибок конструкции зонда или недостатков протокола. Это важные соображения при исследовании тканей, таких как первичные опухоли, где изменение числа копий и гетерогенность являются смешивающими факторами.

Если вы готовы начать проект экзома, потратьте несколько минут на определение покрытия, которое вам понадобится для эксперимента.У нас есть руководство по exome-seq с примерами, которое поможет вам определить количество чтений секвенирования, необходимых для достижения определенного охвата экзома. Если вы планируете приступить к секвенированию всего генома, используйте нашу NGS Matching Engine, которая автоматически рассчитывает объем возможностей секвенирования на различных платформах в соответствии с требованиями к охвату вашего проекта.

Артикул:

1) Влияние глубины секвенирования экзома следующего поколения на открытие диагностических вариантов

Нравится:

Нравится Загрузка…

WGS лучше WES?

Abstract

Текущее клиническое секвенирование следующего поколения выполняется с использованием панелей генов и анализа экзома, оба из которых включают выборочный захват целевых областей. Однако у захвата есть ограничения в достаточном покрытии кодирующих экзонов, особенно богатых GC областей. Мы сравнили секвенирование всего экзома (WES) с самым последним секвенированием всего генома без ПЦР (WGS), показав, что только последнее способно обеспечить беспрецедентно полный охват кодирующей области генома.Таким образом, с клинической / технической точки зрения, WGS является лучшим WES, так что регистрация более не требуется для наиболее полного геномного тестирования менделевских расстройств.

Электронные дополнительные материалы

Онлайн-версия этой статьи (doi: 10.1007 / s00439-015-1631-9) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.

Об оптимальном применении секвенирования следующего поколения (NGS) в диагностике менделевских расстройств ведутся активные дискуссии.Предпочтение отдается генным панелям из-за низких затрат на секвенирование, короткого времени обработки и низкой частоты неспецифических или случайных результатов, в то время как только около 10% мутаций, обнаруживаемых с помощью секвенирования всего экзома (WES), были пропущены (Saudi Mendeliome Group 2015). Фактически, генные панели, связанные с фенотипом пациентов, можно рассматривать как недорогой и быстрый тест первого уровня. Если этот тест отрицательный, WES или полногеномное секвенирование (WGS) можно рассматривать как наиболее полный тест второго уровня.

В WGS охват чтением всего генома может позволить надежное обнаружение вариаций числа копий (CNV), которые могут вносить существенный вклад в бремя болезни (Girirajan et al. 2011). Цены на WGS падают, время обработки, включая анализ данных (например, с использованием GENALICE MAP, www.genalice.com), может быть сокращено до нескольких дней, виртуальные панели генов могут быть выбраны in silico, чтобы избежать случайных выводов, а диагностический результат может быть уменьшен. достигает 73%, что на порядок выше, чем при обычном фенотип-ориентированном анализе отдельных генов (Soden et al.2014; Miller et al. 2015; Виллиг и др. 2015). Таким образом, WGS следует рассматривать как альтернативу WES.

Недавно мы показали, что даже современные платформы WES имеют проблемы с достаточным захватом всего экзома, и предположили, что WGS, который отказывается от захвата, менее чувствителен к содержимому GC и с большей вероятностью, чем WES, обеспечивает полное покрытие всей кодирующей области генома. (Мейенберг и др., 2015). Здесь мы даем новое понимание WGS, показывая, что недавно представленный WGS без ПЦР предлагает беспрецедентно полный охват кодирующей области генома, и, следовательно, WGS вместо WES следует рассматривать как наиболее полный тест второго уровня. .

Мы сравнили оптимальный WES (с использованием Agilent SureSelect v5 + захват UTR; Мейенберг и др., 2015) с WGS (с использованием подготовки библиотеки WGS TruSeq без ПЦР Illumina) в образцах ДНК пяти женщин каждый. Секвенирование было выполнено поставщиками V2 (WES) и V4 (WGS) на HiSeq 2000 при 100 × и системе HiSeq X Ten при 60 × соответственно. Чтобы в значительной степени уменьшить систематические ошибки и артефакты выравнивания, мы ограничили наше сравнение кодирующими последовательностями RefSeq, которые однозначно отображались на X-хромосомные или аутосомные области (Derrien et al.2012), идентичны в геномных сборках hg19 и hg38 и не перекрываются с обычными CNV, перечисленными в базе данных геномных вариантов (DGV, MacDonald et al. 2014). Дополнительные сведения см. В дополнительных электронных материалах.

Наши текущие данные показывают, что новый WGS без ПЦР намного менее чувствителен к содержанию GC и приводит к более равномерному охвату, чем WES и WGS без ПЦР (рис. A, дополнительные рисунки S1-S3). Хотя средняя глубина покрытия была меньше половины (65 × в WGS против 154 × в WES, дополнительная таблица S1), количество кодирующих экзонов RefSeq с полным (100%) покрытием при ≥13 × было значительно больше в без ПЦР. WGS, чем в WES (100.00 против 98,15%; Рис. Б). Разница была более выраженной, когда были исследованы первые экзоны, богатые GC (59 против 51% GC во всех экзонах) (100,00% в WGS без ПЦР против 93,60% в WES; рис. B). В случае генов, рекомендованных Американским колледжем медицинской генетики (ACMG) для регистрации в случае мутации (Green et al.2013), WGS без ПЦР полностью покрывает все уникально картируемые экзоны (100% при ≥13 ×) во всех пяти образцов нашего исследования, тогда как только 98,25% экзонов ACMG были полностью покрыты WES, что привело к полному охвату WES только 75.56% генов ACMG (рис. Б). Заметная и клинически значимая разница в характеристиках WES и WGS также наблюдалась в охвате экзонов, в которых вызывали болезненные мутации (DM, включая однонуклеотидные варианты, а также небольшие (≤20 п.н.) вставки, делеции и индели) были зарегистрированы в HGMD (98,22% в WES против 100,00% в WGS; рис. b). Соответственно, WES может не обнаружить 0,42% (401 / 95,118) известных в настоящее время экзонных DM, обнаруживаемых WGS. Учитывая также идентификацию некодирующих патогенных вариаций (Spielmann and Klopocki, 2013), WES может пропустить всего 0.81% (863/106 819) DM, которые в настоящее время перечислены в HGMD и потенциально могут быть обнаружены WGS (99,19% в WES по сравнению со всеми DM, кроме одного, в WGS; рис. B). Примечательно, что отсечение 13x, представленное здесь, показывает минимальное количество чтений, при котором WGS достигает 100,00% покрытия в наших выборках. Для той же производительности WGS при широко используемом 20-кратном отсечении требуется секвенирование при> 100 × (65 ∗ 20/13) (в то время как для WES большее количество считываний секвенирования может не привести к более полному охвату из-за ограничений захвата, особенно в GC- богатые регионы).

Сравнение производительности WES и WGS. a Средняя глубина считывания кодирующих экзонов RefSeq на содержание GC, показанное для WES, а также для WGS с (WGS_wPCR) и без (WGS) ПЦР как среднее значение пяти образцов для каждого. b Процент полностью покрытых (т. Е. ≥13 считываний в каждом положении нуклеотида) генов, экзонов и вариантов в WES и WGS без ПЦР в виде среднего значения пяти образцов для каждого (столбцы ошибок указывают доверительные интервалы 95%). В случае генов, рекомендованных для отчетности ACMG (гены ACMG, n = 54) и генов базы данных RefSeq (гены RefSeq, n = 16,896), набор всех кодирующих экзонов (все экзоны ACMG, n = 1152; RefSeq все экзоны, n = 177 084) и набор экзонов, содержащих старт-кодон (первые экзоны).Набор экзонов RefSeq, несущих по крайней мере одну вызывающую заболевание мутацию (DM), перечисленный в HGMD (HGMD все экзоны, n = 22 303), и набор всех кодирующих и некодирующих DM (HGMD все варианты, n = 106 819) также были проанализированы. Обратите внимание, что 100,00% подразумевает отклонение не более 0,005%: * два экзона были частично покрыты 12 чтениями; ^# одна интронная мутация была покрыта за 12 чтений; ^и 12 генов были частично покрыты 7–12 чтениями; ^¶ три экзона были частично покрыты 10–12 чтениями; ^§ 12 экзонов были частично покрыты 7–12 прочтениями

Кроме того, однородность покрытия во всем геноме делает WGS, а не WES, подходящим для обнаружения CNV (Gilissen et al.2014; Meienberg et al. 2015). В наших выборках коэффициент вариации (cv = SD / среднее) в охвате экзонами индивидуума в среднем примерно в 4 раза больше в WES, чем в WGS без ПЦР (0,59 против 0,14). По общему признанию, относительное отсутствие равномерного покрытия в WES, по-видимому, не является результатом повышенного уровня шума, поскольку межиндивидуальное cv на экзон сравнимо в WES и WGS (0,08 против 0,09). Другими словами, дополнительная изменчивость покрытия WES представляется воспроизводимой и, следовательно, в принципе может быть нормализована in silico.Однако такие алгоритмы нормализации относительно сложны, их необходимо калибровать для каждого протокола обогащения (Szatkiewicz et al. 2013), и они позволяют обнаруживать только CNV, влияющие на обогащенную область генома. Более того, WGS без пропусков также предлагает обнаружение структурных вариантов (SV) на основе парных и разделенных чтений, что позволяет обнаруживать (нейтральные к копии) SV при разрешении пар оснований (Escaramis et al. 2015). Таким образом, по нашему мнению, WGS, вероятно, заменит методы массивов в обнаружении CNV, тогда как WES может не заменить.

WGS доступен по всему миру в лабораториях, которые имеют возможности высокопроизводительного секвенирования не менее 60 × 3 ∗ 10 ⁹ п.н., а также соответствующие аппаратные и программные ресурсы для обработки и интерпретации больших файлов WGS. Можно возразить, что WGS дороже NGS с выборочным захватом целей. Действительно, генетическая мозаика и панели генов соматического рака требуют нескольких 100-кратных глубин секвенирования для обнаружения низкочастотных нереференсных вариантов, так что WGS в настоящее время будет слишком дорогим для этих приложений.В противном случае, однако, затраты на секвенирование неуклонно снижаются, и усилия по интерпретации данных могут быть сокращены путем in silico выбора соответствующих частей WGS. Учитывая, что эти части могут быть изменены, выборочный захват потребует повторной последовательности нерешенных дел, в то время как с WGS потребуется только повторный анализ существующих данных. Кроме того, можно утверждать, что WGS подразумевает случайное обнаружение мутаций, не связанных с текущим заболеванием пациента, и обнаружение вариантов с неопределенным или неполным эффектом.Опять же, перегрузку такими результатами можно предотвратить, сократив данные WGS до представляющих интерес виртуальных панелей генов. Таким образом, мы и другие (Belkadi et al. 2015; Lelieveld et al. 2015) полагаем, что WGS более эффективен, чем WES в обнаружении вариантов экзома, так что будущая NGS-диагностика менделевских расстройств больше не будет включать методы захвата. В дополнение к предыдущим исследованиям, наши настоящие данные показывают, что WGS без ПЦР обеспечивает даже более равномерный и полный охват экзома, чем WGS с ПЦР во время подготовки библиотеки.

В заключение, производительность WES зависит от содержимого последовательности (GC), а также от дизайна и обогащения. Следовательно, WES не полностью выполняет свою задачу, тогда как новый WGS без ПЦР обеспечивает беспрецедентно полное покрытие экзома и других клинически значимых геномных последовательностей. Таким образом, преимущество WGS не только в выявлении некодирующих патогенных вариаций, но и, ввиду его более полного экзомного покрытия, представленного здесь, это просто лучший WES.Таким образом, WGS без ПЦР следует рассматривать как наиболее полный геномный тест второго уровня. При дальнейшем снижении затрат на секвенирование и использовании соответствующих виртуальных панелей WGS даже может полностью заменить WES и другие методы, предполагающие выборочный захват целевых последовательностей.

Секвенирование всего экзома — обзор

Секвенирование всего экзома и секвенирование всего генома

WES был описан в 2009 году [34] как метод, позволяющий секвенировать экзом, который является частью генома, включающей весь белок. кодирующие области (экзоны).Привлекательность WES заключается в том, что, хотя он охватывает только ~ 1,5% генома, он содержит большинство (~ 85%) вариантов, вызывающих одногенные расстройства. Действительно, в том же году обнаружение врожденной диареи с потерей хлоридов у пациента с ошибочным диагнозом синдрома Барттера было зарегистрировано как первое клиническое применение WES [35]. Отчет о впечатляющей диагностике и терапии тяжелого воспалительного заболевания кишечника с помощью WES продемонстрировал потенциал этой технологии не только для диагностики, но и для лечения [36].

В 2011 году Ambry Genetics, как первая лаборатория, сертифицированная CLIA, предложила WES вместе с медицинской интерпретацией для клинических целей. По состоянию на октябрь 2014 года на веб-сайте GeneTests (www.genetests.org) было перечислено 16 лабораторий, предлагающих клинические WES. Срок выполнения в большинстве случаев составляет 12–13 недель, самый короткий — 4–8 недель, а цена — 4000–5500 долларов США. Примечательно, что стоимость WES может быть всего в два-четыре раза выше, чем стоимость некоторых гораздо более избирательных панелей. Большинство лабораторий также предлагают интерпретацию данных, в том числе в некоторых случаях интерпретацию внешних данных.На веб-сайте GeneTests (www.genetests.org) указана одна лаборатория (Медицинский колледж Висконсина), предлагающая WGS, декларирующая минимальный охват 10 для более 90% генома с периодом обработки 12–13 недель. WGS также можно получить в компаниях Illumina и BGI (www.bgiamericas.com).

WES обычно выполняется с использованием обогащения на основе гибридизации с использованием наборов от Agilent Technologies, Roche NimbleGen, Illumina или других. Хотя все предлагаемые комплекты допускают WES, существуют различия в их конструкции и характеристиках [37].В некоторых случаях наборы охватывают только экзоны, кодирующие белок, тогда как другие наборы включают дополнительные локусы для некодирующих РНК (включая микро РНК) и 5 ​​’, а также 3′ нетранслируемые области. Полученные различия в размере цели (например, 37 МБ для Nextera Rapid Capture Exome от Illumina против 96 МБ для SeqCap EZ Exome + UTR от NimbleGen) подразумевают значительные, до трех раз, различия в стоимости секвенирования.

WES особенно привлекателен, когда есть подозрение, что болезнь вызвана неизвестным локусом — до сих пор WES позволил связать более 150 новых генов с менделевскими расстройствами человека [38].Однако в клинических условиях большая часть информации, предоставляемой WES, остается трудной для интерпретации, поскольку она относится к локусам, которые до сих пор не были связаны с какими-либо заболеваниями человека. Чтобы сосредоточиться на наиболее клинически значимых локусах, были разработаны так называемые панели «клинического экзома», такие как TruSight One от Illumina, который охватывает> 4800 генов и имеет совокупный целевой размер всего ∼12 Mb, или SureSelect Inherited Disease от Agilent (> 2700 генов, 10,5 МБ).

Использование WGS, которое теоретически должно предлагать гораздо более мощный диагностический инструмент, чем WES, в настоящее время ограничено плохим пониманием роли вариаций в некодирующей части генома.Интересно, что исследование 50 пациентов с тяжелой умственной отсталостью, у которых причинный молекулярный дефект не был обнаружен в обширных предыдущих исследованиях, включая WES и сравнительную геномную гибридизацию, пришло к выводу, что WGS имеет высокую диагностическую ценность 42%, но в основном благодаря находкам экзонные варианты, по-видимому, пропущены более ранними исследованиями [39].

Учебное пособие по анализу секвенирования всего экзома

Методы секвенирования следующего поколения (NGS) все больше делают возможным крупномасштабный анализ секвенирования ДНК с массовым параллелизмом.В рамках методов NGS секвенирование всего экзома (WES) направлено на секвенирование и обнаружение вариаций в экзонных областях генома.

Хотя методы полногеномного секвенирования (WGS) могут использоваться для выполнения генетической диагностики, в зависимости от типа и сложности заболевания, WES может быть лучшим методом. WES, во-первых, дешевле — у него более низкие затраты на хранение данных и менее трудоемкий последующий анализ данных, чем у WGS. Значительно сокращается объем хранилища данных: для типичного файла WGS требуется 90 ГБ или более по сравнению с 5–6 ГБ для файла WES.

Самым большим преимуществом WGS является то, что он имеет более широкий охват и позволяет обнаруживать больше типов вариантов. Но даже несмотря на то, что только 2% генома соответствует кодирующим областям, здесь картировано около 90% известных вариантов, вызывающих болезни. Таким образом, несмотря на различия в охвате, анализ секвенирования всего экзома сохраняет свой статус экономически эффективной альтернативы секвенированию всего генома.

Подход WES имеет различные применения от точечного варианта до идентификации структурного варианта.В классе точечных мутаций наиболее часто наблюдаются однонуклеотидные варианты (SNV). К распространенным типам изучаемых SNV относятся синонимичные, бессмысленные, бессмысленные, внутрикадровые мутации, мутации со сдвигом рамки и сайта сплайсинга. Вставки или делеции (инсерции) от 2 до 30 пар оснований — еще один распространенный тип мутации, обнаруживаемый WES. Хотя WGS обычно предпочтительнее для идентификации структурных вариантов, WES также позволяет обнаруживать варианты числа копий (CNV) и другие хромосомные делеции.

Во время последующего анализа идентификация класса мутации имеет сильное влияние на определение клинической значимости варианта. В общем, большинство вариантов, идентифицированных в анализе WES, являются синонимами и, следовательно, не влияют на кодируемый белок, за исключением некоторых конкретных случаев. Точно так же, в зависимости от конструкции набора зондов, WES может также обнаруживать несколько интронных мутаций, которые обычно имеют клиническое значение. Напротив, миссенс-варианты вызывают аминокислотные изменения в белке и могут быть очень информативными в зависимости от механизма заболевания.Нонсенс и мутации сдвига рамки считывания могут иметь резкое влияние на функцию белка, поскольку они вызывают преждевременный стоп-кодон и изменяют рамку считывания ДНК путем вставки или удаления пар оснований соответственно. Более того, внутрикадровые мутации приводят к вставке или удалению пары оснований и, в отличие от мутаций со сдвигом рамки считывания, всегда приводят к триплетным инделениям.

Важным этапом во время WES является обогащение экзонов, при котором кодирующие области захватываются посредством гибридизации ДНК-зондов. Как правило, эти зонды связываются с магнитными шариками, а затем осаждаются и амплифицируются с целевой последовательностью.Доступные коммерческие наборы могут различаться по типу зонда и методу захвата, поэтому важно учитывать используемый набор для захвата экзома — неправильный выбор может привести к неравномерному охвату некоторых регионов. Зонды также могут быть сконструированы по индивидуальному заказу в зависимости от целей расследования. С этой целью можно использовать общедоступные базы данных для выбора целевых регионов для усиления. Однако перед созданием зондов для нацеливания на экзоны необходимо учесть некоторые детали; на качество результатов WES могут влиять многие факторы, такие как области, богатые GC, качество фрагмента ДНК, размер вставки и наличие повторяющихся элементов в последовательности.

Высококачественные результаты анализа экзома во многом зависят от того, как обрабатывается набор данных. Таким образом, протоколы анализа данных секвенирования всего экзома включают в себя несколько этапов, таких как контроль качества (QC), предварительная обработка необработанных считываний, отображение коротких считываний, обработка после выравнивания, вызов и аннотация вариантов, а также приоритезация вариантов. Из-за возможного присутствия примесей и артефактов, таких как ошибки секвенирования, низкое качество чтения, адаптеры и дубликаты, появившиеся в процессе секвенирования, показатели контроля качества оценивают качество данных путем создания основных статистических показателей, касающихся глубины, охвата, идентификации адаптера последовательности. , Содержание GC и базовое распределение.Пайплайны Basepair осуществляют контроль качества с помощью инструмента fastp.

Поскольку в необработанных данных присутствуют артефакты, настоятельно рекомендуются этапы предварительной обработки чтения, такие как обрезка, фильтрация или отсечение адаптера, чтобы избежать смещений сопоставления на этапе выравнивания чтения. Для сопоставления считываний с эталонным геномом Basepair поддерживает два ведущих инструмента: Bowtie и BWA. Оба выполняют сопоставление на основе ссылок. Здесь оцениваются критические показатели контроля качества, такие как глубина и охват областей генома. После этого этапы обработки после выравнивания удаляют многократно отображенные и дублированные считывания, чтобы минимизировать аллельные смещения во время этапа вызова варианта.

На этапе вызова варианта вычисляется вероятность того, что генетический вариант действительно присутствует в анализируемой выборке. Один из самых популярных программных пакетов для вариантного обзвона — GATK. Чтобы избежать ложноположительных вызовов SNP, важно установить правильные параметры, такие как максимальная глубина чтения для каждой позиции, минимальное количество считываний с пропусками и пересчет базового качества выравнивания для улучшения вызываемого базового качества. Кроме того, аннотация вариантов направлена ​​на интеграцию соответствующей информации о каждом вызываемом варианте.Здесь такие программы, как SnpEff / SnpSift и VEP, помогают аннотировать типы вариантов, их влияние на гены (например, изменения в аминокислотах), влияние и частоту встречаемости в человеческих популяциях (например, с использованием базы данных DbSNP). Эта информация имеет решающее значение для выполнения последующей фильтрации и определения приоритетов в анализе секвенирования экзома.

Сотни и тысячи вариантов потенциально могут быть получены путем секвенирования экзома. Здесь очень сложно сократить пространство поиска причинных вариантов.В целом, пользователи могут сортировать найденные варианты по эффекту, влиянию мутаций и зиготности. Могут быть полезны более сложные статистические тесты, хотя они обычно требуют значительного размера выборки. В качестве альтернативы прямой фильтрации данных, используя данные WES, пользователи могут выполнять полногеномные ассоциативные исследования (GWAS), подходы на основе фенотипа или генотипа, ген-специфический анализ и семейные исследования в зависимости от дизайна экспериментального исследования.

Узнайте больше о конвейерах секвенирования всего экзома Basepair на нашей странице продукта.

Список литературы

1. Хинтше, Дженнифер Д., Уильям А. Робинсон и Айк Чун Тан. 2016. «Обзор вычислительных инструментов для анализа и интерпретации данных секвенирования всего экзома». Международный журнал геномики и протеомики, 2016 г. (декабрь): 7983236.

2. Пабинджер, Стефан, Андреас Дандер, Мария Фишер, Рене Снайдер, Майкл Сперк, Мирьяна Ефремова, Биргит Крабихлер, Майкл Р. Спайхер, Йоханнес Зшоке и Златко Траяноски. 2014. «Обзор инструментов для анализа вариантов данных секвенирования генома следующего поколения.Брифинги по биоинформатике 15 (2): 256–78.

3. Реттерер, Кайл, Джейн Юусола, Меган Т. Чо, Патрик Витазка, Франциска Миллан, Федерика Гибеллини, Аннет Вертино-Белл и другие. 2016. «Клиническое применение секвенирования всего экзома по клиническим показаниям». Генетика в медицине: Официальный журнал Американского колледжа медицинской генетики 18 (7): 696–704.

4. Сувински, Павел, Чуангки Онг, Морис Х. Т. Линг, Ян Мин По, Асиф М. Хан и Хуэй Сан Онг. 2019. «Продвижение персонализированной медицины с помощью секвенирования всего экзома и аналитики больших данных.”Frontiers in Genetics 10 (февраль): 49.

Секвенирование экзома: взгляд экспертов | Genome Biology

LGB, JCM

Это открытый вопрос. Вполне возможно, что секвенирование экзома с будущими уточнениями и индексацией образцов могло бы остаться достаточно дешевым, чем WGS, что было бы предпочтительнее WGS для определенных приложений. Для того чтобы экзомы оставались конкурентоспособными, необходимо значительно снизить стоимость комплектов для захвата экзомов, так как затраты на WGS упадут.

Даже если соотношение разницы затрат уменьшится, в настоящее время 6: 1, даже почти до паритета с точки зрения расходных материалов, может быть лучше продолжить использование WES из-за других затрат, которые часто игнорируются.К ним относятся время прибора для секвенирования и вычислительные ресурсы. Там соотношение останется примерно 15: 1 в зависимости от машинного времени и результирующего объема данных. Таким образом, если вы можете создать 1000 экзомов, такое же количество секвенирующих машин может произвести только 67 полных геномов. Если вы действительно хотите собрать 1000 образцов с использованием WGS за те же сроки, что и подход WES, вам потребуется в 15 раз больше машин для секвенирования. Это огромные затраты на капитальные затраты, лабораторные площади и так далее. После инструментов секвенирования объем данных, сгенерированных для WES, также составляет 1/15 объема по сравнению с WGS; таким образом, сетевая и вычислительная инфраструктура значительно упрощается.Уже по этой причине WES может быть привлекательной на долгие годы.

Возможно, срок годности наступит, когда любой, кто хочет или нуждается в секвенировании своего генома, сможет отправить буккальный мазок для WGS за 1000 долларов и получить учетную запись облачных вычислений со своей полной последовательностью. Но даже в этом сценарии ежемесячная стоимость учетной записи с WGS по сравнению с WES, если основываться на объеме данных, будет в 15 раз дороже для WGS, чем для набора данных WES.

KVS

Да, как только разница в стоимости между экзомом и целым геномом уменьшится (что будет в ближайшее время) и будут решены проблемы с управлением и хранением данных, методом выбора будет секвенирование всего генома.Кроме того, в ближайшие несколько лет будет происходить быстрое развитие технологии секвенирования, что приведет к способности секвенировать геном с высоким охватом за очень короткий период времени (несколько дней и, возможно, часы). Когда это станет реальностью, спрос на метод секвенирования экзома будет невелик.

Идентификация мутаций при дистрофиях сетчатки, вызывающих новые и рецидивирующие заболевания, с помощью секвенирования всего экзома (WES): преимущества и ограничения

Abstract

Унаследованные дистрофии сетчатки (IRD) — это менделевские заболевания с огромной генетической и фенотипической гетерогенностью.Поэтому идентификация генетической основы этих дистрофий является сложной задачей. В этом исследовании мы использовали полное секвенирование экзома (WES) в 11 семьях с IRD и идентифицировали варианты, вызывающие заболевание, в 8 из них. Анализ последовательности около 250 IRD-ассоциированных генов выявил 3 ранее описанных связанных с заболеванием варианта в RHO , BEST1 и RP1 . Далее мы идентифицировали 5 новых патогенных вариантов в RPGRIP1 (p.Ser964Profs * 37), PRPF8 (p.Tyr2334Leufs * 51), CDHR1 (p.Pro133Arg и c.439-17G> A) и PRPF31 (p.Glu183_Met193dup). Помимо подтверждения эффективности WES в генетической диагностике IRD, мы документируем проблемы анализа данных и показываем случаи, когда WES упускал из виду основные генетические причины IRD и требовал дополнительных методов. Например, мутация c.439-17G> A в CDHR1 будет оценена как маловероятная при использовании стандартного анализа WES. Только анализ транскриптов в фибробластах пациентов подтвердил патогенную природу этого варианта, который влияет на сплайсинг CDHR1 путем активации скрытого акцепторного сайта сплайсинга.В другом примере дупликация из 33 пар оснований в PRPF31 , пропущенная WES, может быть идентифицирована только с помощью целевого анализа с помощью секвенирования по Сэнгеру. Мы обсуждаем преимущества и проблемы использования WES для выявления мутаций при гетерогенных заболеваниях, таких как IRD.

Образец цитирования: Tiwari A, Lemke J, Altmueller J, Thiele H, Glaus E, Fleischhauer J, et al. (2016) Выявление новых и рецидивирующих мутаций, вызывающих заболевание, при дистрофиях сетчатки с использованием секвенирования всего экзома (WES): преимущества и ограничения.PLoS ONE 11 (7): e0158692. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0158692

Редактор: Дрор Шарон, Медицинский центр Хадасса-Еврейского университета, ИЗРАИЛЬ

Поступила: 7 апреля 2016 г .; Одобрена: 20 июня 2016 г .; Опубликован: 8 июля 2016 г.

Авторские права: © 2016 Tiwari et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все научные данные, которые помогают в понимании статьи, такие как секвенирование по Сэнгеру, родословная задействованного семейства, конвейеры секвенирования и вариантной фильтрации, представлены в документе и его вспомогательных информационных файлах. В соответствии с законами о конфиденциальности пациентов личная информация пациента и членов его семьи, такая как имя, адрес, дата рождения, идентификатор пациента и т. Д., Не будет разглашаться. Эта информация никоим образом не добавляет, не умаляет научного содержания статьи и не препятствует ее полному пониманию.

Финансирование: Это исследование финансировалось за счет гранта Швейцарского национального научного фонда (номер гранта: 320030_138507) для Всемирного банка и JN и от Velux Stiftung, Швейцария, для Всемирного банка. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Унаследованные дистрофии сетчатки (IRD) представляют собой группу редких, но весьма гетерогенных генетических нарушений, характеризующихся аномальной функцией или дегенерацией определенных типов клеток сетчатки, например, фоторецепторов.Следовательно, пострадавшие люди испытывают частичную или полную потерю зрения. Эти заболевания неоднородны не только с точки зрения возраста начала, тяжести и прогрессирования заболевания, но и с точки зрения лежащей в их основе генетики [1]. В настоящее время существует около 250 генов, мутации в которых, как сообщается, вызывают различные формы дистрофий сетчатки. Эти мутации могут передаваться по аутосомно-рецессивному, доминантному или Х-сцепленному типу. Основываясь на клетках, которые поражаются первыми во время прогрессирования заболевания, эти заболевания также классифицируются как палочко-доминантные (например.грамм. пигментный ретинит, RP) или с доминированием конуса (например, дистрофия шишки-палочки, CORD). Более того, было показано, что мутации в одном и том же гене приводят к изменчивым фенотипам, что усложняет уже существующую ситуацию.

Секвенирование всего экзома (WES) — эффективный метод выявления мутаций, вызывающих заболевание, особенно для моногенных наследственных заболеваний, таких как IRD [2–4]. Несмотря на то, что WES является быстрым и точным, он не может идентифицировать мутации, вызывающие заболевание, почти в 35% случаев (Tiwari et al, неопубликованные данные).Возможные причины включают (i) варианты в генах, еще не связанных с заболеванием, (ii) варианты, которые лежат в глубоких интронных областях и, следовательно, не учитываются методами захвата экзома, или (iii) ограничения используемого метода, которые препятствуют эффективной идентификации последовательности. переделки. Дополнительные методы, например Картирование аутозиготности или секвенирование всего генома можно рассматривать для облегчения идентификации генетических изменений, связанных с заболеванием.

Общие диагностические подходы, применяемые в большинстве генетических лабораторий, включают секвенирование по Сэнгеру наиболее часто ассоциированных с заболеванием генов с последующим секвенированием панелей или всего экзома.В этом исследовании большинство случаев было сначала проверено секвенированием по Сэнгеру на предмет вариантов в наиболее вероятных генах-кандидатах. Затем они были подвергнуты секвенированию всего экзома. Первоначальный анализ был направлен на выявление вариантов в пределах 250 генов, связанных с различными формами дистрофий сетчатки. Также были привлечены дополнительные члены семьи для выполнения анализа сегрегации мутации с фенотипом заболевания. Мы представляем примеры случаев, которые подчеркивают проблемы и ограничения анализа данных WES, которые могут иметь значение для процедур, используемых для выявления мутаций в генной диагностике и исследовательских проектах.

Материалы и методы

Заявление об этике

Исследование было проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией и согласно утвержденным протоколам в Цюрихском университете в соответствии с рекомендациями Swissmedic. Разрешение на генетическое тестирование в рамках этого исследования было предоставлено Институту медицинской молекулярной генетики Федеральным управлением общественного здравоохранения (FOPH) в Швейцарии.

Пациенты и семьи

Пациенты и члены их семей были направлены к нам для генетического тестирования из разных офтальмологических клиник.Все пациенты или члены их семей, а также родители пострадавших детей дали письменное информированное согласие на генетическое тестирование. Родословные были составлены с использованием программного обеспечения PED6 (http://www.medgen.de/ped/index.html). Информация о семейном анамнезе, жалобах на зрение и наследовании заболеваний была собрана с помощью стандартного офтальмологического обследования. В это исследование были включены все члены семьи с 5-значным идентификатором пациента, представленные в родословных. Члены семьи, не отмеченные 5-значным идентификатором, не участвовали в этом исследовании, и образцы не анализировались.

Извлечение ДНК

Венозную кровь, взятую у пациентов, использовали для выделения геномной ДНК в двух экземплярах с использованием технологии магнитных шариков с покрытием в соответствии с рекомендациями производителя (PerkinElmer Chemagen Technologie GmbH, Baesweiler, Германия). Целостность ДНК проверяли с помощью Nanodrop (Life technologies, Дармштадт, Германия).

Анализ секвенирования всего экзома (WES)

WES было выполнено в Кельнском центре геномики Кельнского университета с использованием библиотеки экзома человека NimbleGen SeqCap EZ (Roche NimbleGen Inc., Мэдисон, Висконсин) для подготовки библиотеки. Секвенирование 100nt парных концов выполняли на Illumina HiSeq2000. Выравнивание считываний последовательностей, индексация эталонного генома, вызов вариантов и аннотация были достигнуты с использованием конвейера, основанного на BWA [5], Samtools [6], Picard (http://broadinstitute.github.io/picard/) и Annovar [ 7] соответственно. Варианты аннотировали с помощью Alamut-HT (Interactive Biosoftware, Руан, Франция) и визуализировали в Alamut Viewer 2.2 (Interactive Biosoftware, Руан, Франция). Был создан конвейер фильтрации для удаления известных и часто встречающихся SNP или доброкачественных полиморфизмов.Были отобраны варианты с частотой менее 1% в популяции. Варианты, которые были описаны в литературе и базе данных мутаций генов человека (HGMD) как связанные с заболеванием, получили более высокий приоритет. Среди вариантов типов мутации с укорочением белка, ведущие к потере функции, такие как бессмысленные мутации или мутации сдвига рамки считывания, получили более высокий приоритет. Патогенность миссенс-вариантов проверялась пятью алгоритмами предсказания белков SIFT [8], PolyPhen2 [9], MutationTaster2 [10], MAPP [11] и Align GVGD [12, 13].

Дизайн праймера, ПЦР-амплификация и секвенирование по Сэнгеру

Наиболее вероятные варианты, вызывающие заболевание, были подтверждены секвенированием по Сэнгеру у пациента и доступных членов семьи. Праймеры были сконструированы с использованием алгоритма Primer3 [14] и приобретены в Microsynth AG (Балгач, Швейцария). Все целевые области были амплифицированы в двух экземплярах из геномной ДНК пациентов и доступных членов семьи с использованием ДНК-полимеразы Hot FirePol ^® (Solis BioDyne, Тарту, Эстония).Продукты ПЦР очищали путем обработки их реагентом ExoSAP (Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния) и секвенировали с помощью набора для секвенирования Big Dye Terminator Cycle v1.1 (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния, США) и генетического анализатора ABI Prism 3730 (Applied Biosystems). , Карлсбад, Калифорния, США). Анализ данных секвенирования по Сэнгеру выполняли с использованием программного обеспечения Sequencing Analysis Software v5.4, SeqScape v2.6 (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния, США), MutationSurveyorV5.0.0 (Soft Genetics, Пенсильвания, США) и Chromas (Technelysium, Южный Брисбен, Австралия). ) для определения вероятных мутаций, вызывающих заболевание.Мутация определяется, как описано ранее [15].

Клеточные культуры и анализ сплайсинга

Полученные пациентом фибробласты были созданы, как описано ранее [16, 17]. Клетки культивировали в среде MEM, замещенной 10% фетальной телячьей сывороткой, 1,3% L-глутамином, 0,8% раствором антибиотика и антимикотика, и инкубировали при 37 ° C и 5% CO ₂ . 80% конфлюэнтных клеток обрабатывали 100 мкг / мл циклогексимида и инкубировали в течение 4 часов, после чего клетки собирали и общую РНК экстрагировали с использованием мини-набора Qiagen RNeasy (Hombrechtikon, Швейцария).кДНК получали из общей РНК путем обратной транскрипции со случайными праймерами в соответствии с инструкциями производителя (Supercript III, Invitrogen, Базель, Швейцария). Праймеры, перекрывающие интронную область (интрон 5 гена CDHR1 ), были сконструированы для амплификации конкретного продукта в случае активации скрытого сайта сплайсинга в клеточной линии пациента. Была проведена реакция RT-PCR, и продукты PCR были проанализированы на агарозном геле. Продукты ОТ-ПЦР проверяли секвенированием.

Расчет конструкций

Структурное моделирование CDHR1 (эталонная последовательность NP_149091.1), PRPF31 (эталонная последовательность NP_056444.3) и соответствующие последовательности мутантного белка были выполнены на сервере iTasser [18]. Визуализацию сгенерированных структур и их выравнивание выполняли с помощью PyMol (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC).

Результаты

Из 11 случаев с диагнозом RP или CORD мы выявили предполагаемые варианты, связанные с заболеванием, в 8 случаях. Клинические фенотипы пациентов, описания вариантов и прогнозы патогенности этих вариаций последовательности показаны в таблице 1.

Все идентифицированные варианты, описанные в этом исследовании (кроме вариантов RP1 и BEST1 ), отсутствовали в собственной базе данных из 130 экзомов (260 аллелей). RP1 Вариант (NM_006269.1: c.2613dup) был идентифицирован в четырех дополнительных семьях с диагнозом пигментный ретинит. BEST1 вариант (NM_001139443.1: c.242G> A) был гетерозиготным у человека, о котором не известно, что он страдает заболеванием сетчатки (частота аллелей = 0,38% в нашей внутренней базе данных).

WES анализирует

ID случая 27485 (RP, аутосомно-доминантный): индексный пациент — 63-летний пациент мужского пола с диагнозом RP. В семье был аутосомно-доминантный тип наследования, и сын основного пациента также пострадал. Мы идентифицировали гетерозиготную миссенс-мутацию в RHO : NM_000539.3: c.170T> G: p.Leu57Arg (рис. 1a и 1b). Эта мутация была ранее описана [19] (HGMD_PRO = CM063096) и совпадает с заболеванием в семье.Четыре алгоритма предсказания белка предсказывают, что мутация повреждает (таблица 1) и находится в трансмембранном домене.

Рис. 1. Родословные пациентов и последовательная хроматография идентифицированных вариантов, связанных с заболеванием.

Затронутые лица обозначены закрашенными символами, а незатронутые люди обозначены открытыми символами. Индексные пациенты указаны стрелкой и были подвергнуты WES. Варианты обозначены как M1, M2, M3 и M4, а зиготность вариантов указывается в третьих скобках под каждым анализируемым членом семейства.Последовательные хроматографические изображения пациентов и репрезентативных членов семей показаны под эталонной последовательностью. Положение мутации на хроматографе обозначено звездочкой. (a) Семейная родословная пациента 27485. (b) Последовательная хроматография идентифицированного гетерозиготного варианта RHO у пациента (внизу) и здоровой дочери (вверху). (c) Семейная родословная пациента 23880. (d) Последовательная хроматография идентифицированного гетерозиготного варианта PRPF8 у пациента (внизу) и здорового отца (вверху). (e) Семейная родословная пациента 27536. (f) Последовательная хроматография идентифицированного гомозиготного варианта RPGRIP1 у пациента (внизу), гетерозиготной здоровой матери (в центре) и незатронутой сестры (вверху). (g) Семейная родословная пациента 24718. (h) Последовательная хроматография идентифицированного гомозиготного варианта BEST1 у пациента (внизу), незатронутого гетерозиготного отца (в центре) и незатронутой сестры (вверху).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0158692.g001

Идентификационный номер случая 23880 (RP, аутосомно-доминантный): индексный пациент — 35-летний мужчина с больным братом или сестрой. Его мать также пострадала от RP, но не его отец. Были и другие затронутые члены в материнской ветви семьи, что явно указывает на аутосомно-доминантный тип наследования. Новая гетерозиготная дупликация со сдвигом рамки считывания была идентифицирована в PRPF8 в предпоследнем кодоне: NM_006445.3: c.7000dupA: p.Tyr2334 * (рис. 1c и 1d).Этот вариант был выявлен у всех пораженных членов семьи (пациента, его сестры и отца). Незараженные члены семьи не переносили этот вариант.

Идентификационный номер случая 27536 (RP, аутосомно-рецессивный; дифференциальный диагноз: врожденный амавроз Лебера, LCA). Пациентка — 32-летняя женщина от единокровных родителей, не страдающих заболеванием. У нее одна больная и одна здоровая сестра. Новая гомозиготная делеция сдвига рамки считывания была идентифицирована в экзоне 17 (из 24 экзонов) RPGRIP1 у пациента и пораженной сестры: NM_020366.3: c.2890delT: p.Ser964Profs * 37 (рис. 1e и 1f). Эта мутация приводит к сдвигу рамки считывания и преждевременным триплетам стоп-кодона 37 после мутации. Вызов варианта NGS первоначально предполагал гетерозиготную мутацию в RPGRIP1 . Мутация была исключена у здоровой сестры и матери. Образцы от отца пациента не были доступны, но можно предположить, что он, как и мать, также является носителем этой мутации.

Идентификационный номер случая 24718 (конусно-стержневая дистрофия, аутосомно-рецессивный): Гомозиготная миссенс-мутация в BEST1 была идентифицирована у пораженного индексного пациента (24718) и его пораженного брата (24719): NM_001139443.1: c.242G> A: p.Arg81His. Они унаследовали по одному мутантному аллелю от каждого родителя; оба гетерозиготных носителя мутации (рис. 1g и 1h). Все остальные члены семьи не подвержены влиянию и не проявляют никаких проявлений, связанных с бестрофином. Они являются либо гетерозиготными носителями (28218, 28549, 24990 и 24989), либо не носителями (28197 и 28177) мутации. Ранее сообщалось, что эта мутация вызывает заболевание [20–22] (HGMD_PRO = CM001382). Предполагается, что он будет вредным (SIFT), вероятно, повреждающим (оценка Polyphen2 = 1.0) и вызывающие болезни (MutationTaster2).

Идентификационный номер случая 26165 (RP, аутосомно-доминантный): индексный пациент — женщина 54 лет с двумя больными братьями, 3 здоровыми братьями и сестрами, больным отцом и здоровой матерью. Родословная указывает на аутосомно-доминантный тип наследования (рис. 2а). Гетерозиготная вставка со сдвигом рамки считывания была обнаружена в экзоне 4 в RP1 (последний экзон): NM_006269.1: c.2613dup: p.Arg872Thrfs * 2 (рис. 2b). Этот сдвиг рамки считывания приводит к преждевременному стоп-кодону, на 2 триплета ниже мутации.Мутация совмещена с заболеванием внутри семьи (рис. 2а). Ранее он был описан как связанный с заболеванием [23] (HGMD_PRO = CI004598). Мутация отсутствовала в этнически подобранной контрольной когорте, представляющей 576 аутосомных аллелей.

Рис. 2. Родословные пациентов и последовательная хроматография идентифицированных вариантов, связанных с заболеванием.

Варианты обозначены как M5. (a) Семейная родословная пациента 26165. (b) Последовательная хроматография идентифицированного гетерозиготного варианта RP1 у пациента (внизу) и здоровой сестры (вверху). (c) Семейная родословная пациента 25900. (d) Последовательная хроматография идентифицированного гетерозиготного варианта RP1 у пациента (внизу), у здоровой сестры, несущей этот вариант (в центре), и у здоровой матери (вверху). β: Известный полиморфизм в положении c.2618 в гене RP1 с частотой 26,98% у европейцев (Источник: Exome Aggregation Consortium).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0158692.g002

Идентификатор случая 25900 (RP, аутосомно-доминантный): индексный пациент — 47-летняя женщина с больным отцом.Ее мать и двое братьев и сестер не пострадали (рис. 2c). Такая же вставка со сдвигом рамки кадра в RP1 , как описано выше, была обнаружена у пациента и пострадавшего отца: NM_006269.1: c.2613dup: p.Arg872Thrfs * 2. Мутация также была идентифицирована у двух дополнительных членов этого семейства (28223 и 28109), у которых не было никаких симптомов заболевания при первом клиническом обследовании в возрасте 37 и 40 лет соответственно (рис. 2c и 2d).

ID случая 26007 (RP, аутосомно-рецессивный): Пациент — 59-летняя женщина, с клиническим диагнозом RP.Ее родители не пострадали (рис. 3а). Мы обнаружили новые сложные гетерозиготные мутации в CDHR1 , кодирующем родственного кадгерину члена семейства 1, в ДНК пациента. Она унаследовала по одному мутантному аллелю от каждого родителя (рис. 3b и 3c). (i) NM_033100.2: c.398C> G: p.Pro133Arg (Missense) был передан по материнской линии. Это приводит к замене высококонсервативного пролина на аргинин (S1 фиг., красный прямоугольник ). Предполагается, что это опасно (SIFT) и вызывает болезни (MutationTaster2).Структурное предсказание с использованием iTasser показало, что этот миссенс-вариант приводит к созданию короткого бета-листа в мутантном белке, который лежит в первом кадгериновом домене CDHR1 (рис. 3d и 3e). (ii) NM_033100.2: c.439-17G> A была унаследована от ее отца. Этот вариант расположен на 17 оснований выше экзона 6 и, по прогнозам, генерирует криптический акцепторный сайт сплайсинга в интроне 5 (фиг. 4, , зеленый прямоугольник ). Значения предсказания нового акцептора сплайсинга с использованием пяти различных алгоритмов предсказания сплайсинга (подобные SpliceSite Finder, MaxEntScan, NNSPLICE, GeneSplicer и Human Splicing Finder) сопоставимы с таковыми для канонического акцепторного сайта сплайсинга, начиная с консервативного акцептора сплайсинга экзона 6 ( Рис 4 вставка: синий прямоугольник , таблица 2).Кажется вероятным, что этот новый акцепторный сайт сплайсинга используется аппаратом сплайсинга в дополнение к каноническому сайту. Это приводит к удлинению экзона на 15 п.н. и генерированию стоп-кодона из 3 пар оснований ниже криптического акцепторного сайта сплайсинга (рис. 4, красный прямоугольник ). Оба варианта отсутствовали в этнически подобранной контрольной когорте из 576 аллелей.

Рис. 3. Родословные пациентов и последовательная хроматография идентифицированных вариантов, связанных с заболеванием.

Варианты обозначены как M6, M7 и M8. (a) Семейная родословная пациента 26007. (b) Последовательная хроматография гетерозиготного CDHR1 варианта c.398C> G у пациента (внизу), матери-носителя (в центре) и отца (вверху). (c) Последовательная хроматография гетерозиготного CDHR1 варианта c.439-17G> A у пациента (внизу), матери (в центре) и отца-носителя (вверху). (d) Предсказанная структура эталонного белка CDHR1 (синим цветом), выровненная с мутантным CDHR1 (p.Pro133Arg) (оранжевым цветом).Мутация показана пурпурными сферами и локализована в первом кадгериновом домене (белый прямоугольник). (e) Увеличенное изображение первого домена кадгерина CDHR1 показывает дополнительный бета-лист (белая стрелка), близкий к мутации (f) Родословная семьи пациента 23530. (g) Изображение геля агарозы PRPF31 ПЦР экзона 7 показывает большую полосу только у пораженных членов, что указывает на дупликацию. C = Контроль воды в ПЦР. (h) Сравнение предсказанных моделей последовательности эталонного белка PRPF31 (i и v, зеленые), мутантного PRPF31 (ii и vi, пурпурный), выравнивание эталонного и мутантного PRPF31 (iii и viii) и увеличенное изображение выравнивание по сайту мутации (iv и viii).Дополнительный виток мутанта в домене coiled-coil показан белым цветом. Первая аминокислота дупликации 11 п.н. показана белой стрелкой. «N» обозначает N-конец белка.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0158692.g003

Рис. 4. CDHR1 интронный вариант.

Снимок визуального изображения Аламута, показывающий интронный вариант (c.439-17G> A) у пациента 26007 (зеленый прямоугольник). Файл выравнивания bam ясно показывает гетерозиготный вариант 17bp выше экзона 6.Врезка: снимок алгоритмов прогнозирования сращивания ( in silico ) показывает сильное загадочное усиление акцептора сращивания в месте варианта (синий прямоугольник). Значения сопоставимы со значением канонического акцепторного сайта сплайсинга. Красный прямоугольник показывает стоп-кодон в рамке для скрытого сайта активатора сплайсинга.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0158692.g004

Поскольку за сайтом сплайсинга следует стоп-кодон, мы предположили, что на мутантный транскрипт может влиять нонсенс-опосредованный распад мРНК.Чтобы проверить эту гипотезу, мы обработали фибробласты, полученные из биопсии кожи пациента, по сравнению с контрольными фибробластами (не несущими эти мутации в CDHR1 ) циклогексимидом и ДМСО в качестве контроля. Впоследствии мы выделили общую РНК из этих клеточных линий и выполнили ОТ-ПЦР. После гель-электрофореза мы идентифицировали аберрантный продукт ОТ-ПЦР (рис. 5b, белая звездочка) в клеточной линии пациента, обработанной циклогексимидом. Ожидаемый размер этого продукта был 140 п.п. Продукт не амплифицировался в контрольной клеточной линии после обработки ДМСО или циклогексимидом, а также в клеточной линии пациента, обработанной ДМСО (фиг. 5b).После секвенирования этого продукта ПЦР мы подтвердили, что у этого пациента произошла предполагаемая активация сайта сплайсинга. Он включал вставку 15 п.н. из интрона 5 CDHR1 , что соответствует предсказанной криптической активации сплайсинга, происходящей из-за мутации c.439-17G> A (фиг. 5c и вставка 4 ).

Рис. 5. Анализ альтернативного сплайсинга in vitro .

(a) Дизайн праймера для фиксации предполагаемого удерживания интрона из-за варианта c.439-17G> A в CDHR1 . (b) Электрофорез в агарозном геле для ОТ-ПЦР, показывающий продукт ПЦР размером 140 пар оснований только в клеточной линии пациента (белая звездочка). Никаких продуктов не было обнаружено ни в контрольной клеточной линии, ни в контроле воды. (c) Внизу: хроматографическая последовательность показывает четкое удерживание 15 п.н. от интрона 5 в продукте ОТ-ПЦР, образованное из-за активации скрытого сайта сплайсинга. Вверху: Схема, представляющая границы экзон-интрон, наблюдаемые в продукте ОТ-ПЦР.

https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0158692.g005

ID случая 23530 (RP, аутосомно-доминантный): индексный пациент — 43-летний мужчина с больным братом-близнецом, вторым больным братом, здоровой сестрой и здоровой матерью (рис. 3е). Сообщается, что отец пострадал. Среди известных генов RP не было выявлено мутации, объясняющей заболевание, с использованием WES у этого пациента. Однако при скрининге генов-кандидатов с помощью секвенирования по Сэнгеру была обнаружена новая дупликация из 33 пар оснований в гене PRPF31 (NM_015629.3: c.548_580dup: p.Glu183_Met193dup), который совпадает с заболеванием в семье. Дупликация наблюдалась только у пораженных членов семьи, что видно по более крупному продукту ПЦР на агарозном геле (рис. 3g). Структурный анализ мутантного белка PRPF31, согласованного со структурой эталонного белка, предсказывает генерацию дополнительного витка из-за этой дупликации из 11 аминокислот во втором спиральном домене альфа-спирали белка PRPF31 (рис. 3h). Модель с наивысшей степенью достоверности (c-score) предсказала, что дополнительный поворот был продолжением существующей альфа-спирали (рис. 3hi – 3hiv).Вторая модель предполагает, что этот дополнительный виток спирали выходит из домена спиральной катушки (Рис. 3hv – 3hviii). В обеих моделях предполагается, что мутация приведет к потере N-концевой альфа-спирали (рис. 3h, обозначенный буквой N зеленого цвета для эталонного PRPF31 и пурпурного цвета для мутантного PRPF31).

В трех семьях (одна с предполагаемым доминантным типом наследования и два потенциально рецессивных случая) мы не смогли обнаружить мутации в генах, в настоящее время связанных с IRD, которые могли бы объяснить фенотип заболевания на основе предполагаемого способа наследования (рис. ).Эти случаи в настоящее время исследуются для выявления новых мутаций генов, связанных с заболеванием.

Рис. 6. Родословные семей, в которых основные генетические мутации не были идентифицированы.

(a) Семейная родословная пациента 22538 с диагнозом CORD. (б) Семейная родословная пациента 26309 с диагнозом РПЖ. (c) Семейная родословная пациента 23609 с диагнозом CORD.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0158692.g006

Обсуждение

IRD демонстрируют необычайную генетическую и фенотипическую гетерогенность.Эти заболевания сетчатки в настоящее время связаны с мутациями более чем 250 генов. С появлением секвенирования следующего поколения (NGS) идентификация генетической основы IRD произвела революцию. Генетическая диагностика с помощью секвенирования панелей или всего экзома оказалась надежным и быстрым методом с зарегистрированной диагностической эффективностью между 50–65% [15, 24–27] (Tiwari et al, неопубликованные данные). Хотя это число выше по сравнению с обычным секвенированием по Сэнгеру и подходами к генам-кандидатам, значительный процент случаев все еще остается невыявленным.Эти недиагностированные пациенты реже встречаются для синдромных случаев [15] и в случаях в кровнородственных популяциях, где анализ мутаций на основе аутозиготности в сочетании с WES / NGS показал более высокую диагностическую эффективность [28, 29]. Мы использовали хорошо зарекомендовавший себя метод скрининга образцов пациентов на наличие мутаций в наиболее вероятных генах-кандидатах и ​​подтвердили идентифицированные варианты у дополнительных членов семьи с помощью анализа сегрегации. Некоторых пациентов предварительно обследовали на наличие мутаций в вероятных генах-кандидатах ( RHO , PRPh3 , RP2 , RPGR , CRX , NRL) с использованием секвенирования по Сэнгеру.В этом исследовании, в котором участвовала одна кровно-кровная семья, мы смогли выявить варианты, вызывающие болезнь, в 7 из 11 случаев с помощью WES. Связанный с заболеванием вариант в дополнительном случае был идентифицирован только секвенированием по Сэнгеру. Наша когорта состояла из 8 случаев RP и 3 случаев CORD, семь и один из которых показали положительные результаты в этом исследовании, соответственно. Мы идентифицировали 3 ранее описанные мутации в 4 семьях и 5 новых вариантов в 4 семьях. Типы вариантов включали 3 сдвига рамки считывания, 3 миссенс-мутации и 1 сплайс-мутацию, а также 1 дупликацию 33 п.н.

Несмотря на то, что это привело к более высокому уровню успешности диагностики, при анализе данных NGS требуется осторожность, особенно при заболеваниях с значительной генетической гетерогенностью, таких как IRD. Идентификация вариантов, связанных с заболеванием, иногда очень проста, как в случае 27485 (рис. 1a), где известная миссенс-мутация в RHO была идентифицирована у пораженных членов семьи. Мутации в RHO составляют большинство случаев аутосомно-доминантного RP. Это может быть немного сложнее, если в гене выявлено очень мало мутаций.Например, в случае 23880 (рис. 1c), в котором была идентифицирована новая дупликация одного нуклеотида в предпоследнем кодоне PRPF8 . Мутации в PRPF8 являются одной из наименее частых причин доминантного RP, и, следовательно, этот ген с меньшей вероятностью будет подвергаться скринингу с помощью секвенирования по Сэнгеру в рамках традиционного диагностического лабораторного скрининга. Аминокислоты 2301–2335 на C-конце PRPF8, как известно, взаимодействуют с EFTUD2 и SNRNP200 [30–32], и было показано, что многие мутации, приводящие к RP, группируются в C-концевом домене PRPF8 [30, 33].Предполагается, что неэффективная репрессия SNRNP200 из-за мутаций на C-конце PRPF8 связана с PRPF8-связанным RP [34]. Нонсенс-мутация p.Tyr2334 * в PRPF8 у пациента 23880 генерирует кодон преждевременной терминации в белке. Однако, поскольку она находится в составе предпоследней аминокислоты, потерю функции нельзя объяснить бессмысленным распадом. Скорее всего, это приводит к неэффективному подавлению функции SNRNP200 или потере взаимодействия с EFTUD2 или SNRNP200.

Если используется панельный подход, анализ ограничивается генами, связанными с конкретным заболеванием.Например, в случае 27536 (рис. 1e) первичным клиническим диагнозом была RP с дифференциальным клиническим диагнозом врожденный амавроз Лебера (LCA). Панель RP обычно исключает RPGRIP1 , потому что большинство мутаций, описанных в RPGRIP1 , были связаны с LCA (n = 77, источник: HGMD), а очень немногие — с RP (n = 4, источник: HGMD), что привело к неудачной генетической диагностике. В этом случае мы идентифицировали новую делецию со сдвигом рамки считывания у всех затронутых членов семьи в экзоне 17 (из 24) RPGRIP1 (стр.Ser964Profs * 37), что приводит к триплетам преждевременного терминирующего кодона 37 ниже мутации и, скорее всего, приводит к несмысловому распаду транскрипта. Ретроспективно дифференциальный диагноз LCA может более точно описать клинический фенотип у этого пациента. Точно так же в случае 24718 CORD возникает из-за ранее описанной гомозиготной миссенс-мутации в BEST1 (p.Arg81His) [20]. Хотя большинство мутаций BEST1 наследуются доминантно, мутации BEST1 связаны как с рецессивными, так и с доминантными формами макулярной дистрофии Беста [35]. BEST1 не является наиболее вероятным кандидатом для CORD, и поэтому BEST1 будет исключен из типичной панели диагностических генов CORD. Функциональные исследования показали, что эта мутация приводит к снижению хлоридной проводимости и усилению протеасомной деградации белка BEST1 [21, 22, 36].

Конвейеры анализа и алгоритмы вызова вариантов постоянно улучшаются, поэтому вероятность неправильного вызова может создать проблемы при анализе. Например, в случае 27536 зиготность мутации RPGRIP1 c.2890delT был аннотирован как гетерозиготный, а не гомозиготный. Поскольку родители были кровнородственными и незатронутыми, мы ожидали, что в этом случае гомозиготный или составной гетерозиготный вариант (ы) будет причиной заболевания. Только после подробного повторного анализа этой специфической мутации мы определили, что последовательность включала 6 прочтений Т-аллеля и 49 делеций Т-аллеля, что свидетельствует об атипичном балансе аллелей (<20% референсного аллеля) в сочетании со смещением цепи Т -аллеле (S2 фиг.). После проверки Сэнгером мы могли подтвердить гомозиготность этой делеции.

, которые могут быть либо рецессивно, либо доминантно унаследованы, либо проявлять неполную пенетрантность, особенно затрудняют точную интерпретацию генетических данных и результатов, например, RP1 . В семьях пациентов 26165 и 25900 была идентифицирована ранее описанная доминантно наследуемая дупликация сдвига рамки считывания в RP1 [23] (Fig 2a-2d). В семье пациента 26165 все пораженные члены были гетерозиготными по мутации, а незатронутые члены семьи не несли мутацию.Однако в семье пациента 25900 двое здоровых братьев и сестер (один брат и одна сестра) также были гетерозиготными по мутации (рис. 2c и 2d). Это может быть связано с неполной пенетрантностью, поскольку было показано, что доминантные мутации в RP1 обладают переменной экспрессией [37, 38]. Более поздний возраст начала заболевания у этих членов семьи также может объяснить это несоответствие. Следовательно, в этих случаях потребуется повторное клиническое обследование. Мы также идентифицировали эту мутацию в четырех дополнительных семьях с аутосомно-доминантным RP в нашей когорте (данные не показаны), что подтверждает патогенность варианта последовательности.

CDHR1 принадлежит к суперсемейству кадгеринов кальций-зависимых молекул клеточной адгезии. Он кодирует специфичный для фоторецепторов кадгерин, который играет роль в морфогенезе внешнего сегмента диска. Это может быть необходимо для структурной целостности внешнего сегмента фоторецепторных клеток и, как было показано, взаимодействует с PROM1 [39]. Мы идентифицировали сложные гетерозиготные мутации в трио, где индексный пациент был поражен RP (рис. 3a). Миссенс вариант в CDHR1 (Pro133Arg) влияет на высококонсервативную аминокислоту и локализуется в первом кадгериновом домене белка.Структурный анализ предсказал появление нового бета-листа в этом кадгериновом домене из-за миссенс-варианта. Кадгерины участвуют в кальций-зависимой межклеточной адгезии. Другая замена пролина была идентифицирована в конце пятого домена кадгерина у пациента с испанским RP [40]. Можно предположить, что мутация нарушает адгезионную роль кадгеринового домена в межклеточной адгезии. В качестве альтернативы он может опосредовать свою патогенность с помощью механизма, еще не описанного для CDHR1. Было предсказано, что вариант c.439-17G> A CDHR1 активирует криптический сайт активатора сплайсинга in silico .Эта активация была подтверждена с использованием фибробластов пациента в клеточной линии, полученной от пациента. Часто фокус идентификации мутации находится в кодирующих областях. Изменения сплайсинга, затрагивающие положения +/- 2 и +5 пар оснований вокруг экзонов, также имеют значение. Однако области заполнения также могут нести мутации, которые могут привести к альтернативному сплайсингу. Эти области сильно различаются между экзонами и зависят от используемого метода обогащения. Кроме того, варианты, расположенные на концах областей набивки, обычно демонстрируют смещение прядей и, таким образом, исключаются из многих конвейеров анализа.Следовательно, важно тщательно анализировать область «заполнения» захватывающих экзом последовательностей, чтобы не пропустить мутации, лежащие дальше от канонических акцепторных и донорных сайтов сплайсинга. Это также подчеркивает необходимость функциональных анализов для проверки прогнозируемых эффектов вариантов, например, миссенс-сайтов или изменений сайтов сплайсинга. В этом случае только анализ транскрипта клеточной линии, полученной от пациента, подтвердил дефект сплайсинга.

У пациента 23530 ни один из вариантов, идентифицированных при WES, не объясняет доминантный фенотип RP в семье.Мы включили ДНК пациентов в проект скрининга по Сэнгеру гена PRPF31 , мутации которого составляют второе по величине количество связанных с заболеванием мутаций в случаях аутосомно-доминантного RP. При секвенировании по Сэнгеру новая дупликация 33 п.н. была идентифицирована в PRPF31 у пациента и всех затронутых членов семьи. Этот случай иллюстрирует важное ограничение этого подхода NGS, при котором большая дупликация была упущена в данных WES, но могла быть идентифицирована только с помощью обычного секвенирования по Сэнгеру.Структурный анализ предсказывает генерацию дополнительного витка в альфа-спирали домена coiled-coil белка. Вероятно, мутация нарушает взаимодействие PRPF31 с PRPF6 [41]. Улучшенные алгоритмы биоинформатики для обнаружения дупликаций или делеций более 20 пар оснований могут помочь в идентификации таких мутаций. Однако такие специфические анализы обычно не используются, и поэтому важно рассмотреть возможность использования альтернативных методов анализа в случаях, когда генетический диагноз еще не установлен.

В заключение, наше исследование показывает силу WES в выявлении патогенных мутаций в IRD с вероятностью успеха 63%, но также и с его ограничениями. В каждом случае может быть несколько мутаций в разных генах, в дополнение к вариациям последовательности de-novo, которые могут не сочетаться с заболеванием [15]. Более того, мутации, расположенные внутри и за пределами захваченных экзонных областей, должны быть тщательно оценены на предмет влияния на сплайсинг или дополнительных регуляторных эффектов. Кроме того, дополнительный подход к WES может быть очень полезным для выявления мутаций, связанных с IRD, в случаях, когда генетический диагноз отсутствует.

Вспомогательная информация

S2 Рис. Скриншот Alamut для

Эта делеция 1bp, приводящая к сдвигу рамки считывания, была аннотирована как гетерозиготная. Значения прочтений на вставке показывают 49 делеций и 6 Т-аллелей (что показывает смещение цепи). Секвенирование по Сэнгеру подтвердило гомозиготность этой делеции.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0158692.s002

(TIF)

Благодарности

Авторы благодарят всех пациентов и членов их семей за участие.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: AT JN WB. Проведены эксперименты: AT JA EG HT. Проанализированы данные: AT EG HT. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: PN JN WB. Написал статью: AT JN WB. Собранные образцы от пациентов и членов их семей: JL JF JN WB. Выполнен клинический анализ пациентов: JF.

Ссылки

1. 1. Berger W, Kloeckener-Gruissem B, Neidhardt J. Молекулярные основы заболеваний сетчатки и витреоретинала человека.Прогресс в исследованиях сетчатки и глаз. 2010. 29 (5): 335–75. pmid: 20362068.
2. 2. Эллингфорд Дж. М., Бартон С., Бхаскар С., О’Салливан Дж., Уильямс С. Г., Лэмб Дж. А. и др. Молекулярные исследования 537 человек с наследственным заболеванием сетчатки. Журнал медицинской генетики. 2016. pmid: 27208204.
3. 3. Кортон М., Нисигучи К.М., Авила-Фернандес А., Никопулос К., Ривейро-Альварес Р., Тату С.Д. и др. Секвенирование экзома индексных пациентов с дистрофиями сетчатки как инструмент молекулярной диагностики.ПлоС один. 2013; 8 (6): e65574. pmid: 23940504; PubMed Central PMCID: PMC3683009.
4. 4. Хуан Л., Сяо Х, Ли С., Цзя Х, Ван П, Сунь В. и др. Молекулярная генетика дистрофии колбочек-стержней у китайских пациентов: новые данные от 61 пробанда и обзор мутаций 163 пробандов. Экспериментальное глазное исследование. 2016; 146: 252–8. pmid: 26992781.
5. 5. Ли Х, Дурбин Р. Быстрое и точное согласование короткого чтения с преобразованием Барроуза-Уиллера. Биоинформатика. 2009. 25 (14): 1754–60. pmid: 19451168; PubMed Central PMCID: PMC2705234.
6. 6. Ли Х, Хандакер Б., Вайсокер А., Феннелл Т., Руан Дж., Гомер Н. и др. Формат Sequence Alignment / Map и SAMtools. Биоинформатика. 2009. 25 (16): 2078–9. pmid: 19505943; PubMed Central PMCID: PMC2723002.
7. 7. Ван К., Ли М., Хаконарсон Х. ANNOVAR: функциональная аннотация генетических вариантов на основе данных высокопроизводительного секвенирования. Исследование нуклеиновых кислот. 2010; 38 (16): e164. pmid: 20601685; PubMed Central PMCID: PMC2938201.
8. 8. Кумар П., Хеникофф С., Нг ПК.Прогнозирование влияния кодирования несинонимичных вариантов на функцию белка с использованием алгоритма SIFT. Протоколы природы. 2009. 4 (7): 1073–81. pmid: 19561590.
9. 9. Аджубей И.А., Шмидт С., Пешкин Л., Раменский В. Е., Герасимова А., Борк П. и др. Метод и сервер для предсказания повреждающих миссенс-мутаций. Природные методы. 2010. 7 (4): 248–9. pmid: 20354512; PubMed Central PMCID: PMC2855889.
10. 10. Schwarz JM, Cooper DN, Schuelke M, Seelow D. MutationTaster2: предсказание мутации для возраста глубокого секвенирования.Природные методы. 2014; 11 (4): 361–2. pmid: 24681721.
11. 11. Stone EA, Sidow A. Нарушение физико-химических ограничений миссенс-заменами опосредует нарушение функции белка и тяжесть заболевания. Геномные исследования. 2005. 15 (7): 978–86. pmid: 15965030; PubMed Central PMCID: PMC1172042.
12. 12. Мате Э., Оливье М, Като С., Ишиока С., Эно П., Тавтиджан С.В. Вычислительные подходы к прогнозированию биологического эффекта миссенс-мутаций p53: сравнение трех методов, основанных на анализе последовательностей.Исследование нуклеиновых кислот. 2006. 34 (5): 1317–25. pmid: 16522644; PubMed Central PMCID: PMC13.
13. 13. Тавтиджан С.В., Деффенбо А.М., Инь Л., Джудкинс Т., Шолл Т., Самоллоу П.Б. и др. Комплексное статистическое исследование 452 миссенс-замен BRCA1 с классификацией восьми повторяющихся замен как нейтральных. Журнал медицинской генетики. 2006. 43 (4): 295–305. pmid: 16014699; PubMed Central PMCID: PMC2563222.
14. 14. Untergasser A, Cutcutache I, Koressaar T., Ye J, Faircloth BC, Remm M, et al.Primer3 — новые возможности и интерфейсы. Исследование нуклеиновых кислот. 2012; 40 (15): e115. pmid: 22730293; PubMed Central PMCID: PMC3424584.
15. 15. Glockle N, Kohl S, Mohr J, Scheurenbrand T, Sprecher A, Weisschuh N и др. Секвенирование следующего поколения на основе панелей как надежный и эффективный метод обнаружения мутаций у невыбранных пациентов с дистрофиями сетчатки. Европейский журнал генетики человека: EJHG. 2014; 22 (1): 99–104. pmid: 235; PubMed Central PMCID: PMC3865404.
16. 16.Глаус Э., Шмид Ф., Да Коста Р., Бергер В., Нейдхардт Дж. Генный терапевтический подход с использованием адаптированной к мутации U1 snRNA для исправления дефекта сплайсинга RPGR в клетках, полученных от пациента. Молекулярная терапия: журнал Американского общества генной терапии. 2011; 19 (5): 936–41. pmid: 21326217; PubMed Central PMCID: PMC3098652.
17. 17. Виллегас Дж, Макфол М. Создание и культура фибробластов кожи человека. Современные протоколы в молекулярной биологии / под редакцией Фредерика М. Осубеля [и др.].2005; Глава 28: Блок 28 3. pmid: 18265368.
18. 18. Рой А., Кучукурал А., Чжан Ю. I-TASSER: унифицированная платформа для автоматизированного прогнозирования структуры и функции белков. Протоколы природы. 2010. 5 (4): 725–38. pmid: 20360767; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC2849174.
19. 19. Салливан Л.С., Боун С.Дж., Берч Д.Г., Хьюбэнкс-Уитон Д., Хекенливли Дж. Р., Льюис Р.А. и др. Распространенность болезнетворных мутаций в семьях с аутосомно-доминантным пигментным ретинитом: скрининг известных генов в 200 семьях.Исследовательская офтальмология и визуализация. 2006. 47 (7): 3052–64. pmid: 16799052; PubMed Central PMCID: PMC2585061.
20. 20. Крамер Ф., Уайт К., Паулейхофф Д., Гериг А., Пассмор Л., Ривера А. и др. Мутации в гене VMD2 связаны с ювенильным началом желточно-желточной дистрофии (болезнь Беста) и желточно-желточной дистрофией желтого пятна у взрослых, но не с возрастной дегенерацией желтого пятна. Европейский журнал генетики человека: EJHG. 2000. 8 (4): 286–92. pmid: 10854112.
21. 21.Дэвидсон А.Е., Миллар И.Д., Берджесс-Муллан Р., Махер Дж. Дж., Уркхарт Дж. Э., Браун П.Д. и др. Функциональная характеристика миссенс-мутаций бестрофина-1, связанных с аутосомно-рецессивной бестрофинопатией. Исследовательская офтальмология и визуализация. 2011. 52 (6): 3730–6. pmid: 21330666.
22. 22. Джонсон А.А., Бахман Л.А., Жиль Б.Дж., Кросс С.Д., Стелциг К.Э., Реш З.Т. и др. Аутосомно-рецессивная бестрофинопатия не связана с потерей функции анионного канала бестрофина-1 у пациента с новой мутацией BEST1.Исследовательская офтальмология и визуализация. 2015; 56 (8): 4619–30. pmid: 26200502; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4515977.
23. 23. Пейн А., Витана Е., Халик С., Хамид А., Деллер Дж., Абу-Сафие Л. и др. Мутации, усекающие белок RP1, преобладают в локусе adRP RP1. Исследовательская офтальмология и визуализация. 2000. 41 (13): 4069–73. pmid: 11095597.
24. 24. Consugar MB, Navarro-Gomez D, Place EM, Bujakowska KM, Sousa ME, Fonseca-Kelly ZD, et al. Панельное генетическое диагностическое тестирование наследственных заболеваний глаз является очень точным и воспроизводимым, а также более чувствительным для выявления вариантов, чем секвенирование экзома.Генетика в медицине: официальный журнал Американского колледжа медицинской генетики. 2015. 17 (4): 253–61. pmid: 25412400.
25. 25. Zhao L, Wang F, Wang H, Li Y, Alexander S, Wang K и др. Молекулярная диагностика 82 пробандов пигментного ретинита на основе секвенирования нового поколения из Северной Ирландии. Генетика человека. 2015; 134 (2): 217–30. pmid: 25472526; PubMed Central PMCID: PMC4347882.
26. 26. Березкин А., Шевах Е., Кимчи А., Мизрахи-Мейссонье Л., Хатеб С., Ратнаприя Р. и др.Секвенирование всего экзома выявляет мутации в генах известных заболеваний сетчатки в 33 из 68 израильских семей с унаследованными ретинопатиями. Научные отчеты. 2015; 5: 13187. pmid: 26306921; PubMed Central PMCID: PMC4549705.
27. 27. Сюй И, Гуань Л., Шен Т., Чжан Дж., Сяо Х, Цзян Х. и др. Мутации 60 известных причинных генов в 157 семьях с пигментным ретинитом на основе секвенирования экзома. Генетика человека. 2014; 133 (10): 1255–71. pmid: 24938718.
28. 28. Абу-Сафие Л., Альрашед М., Анази С., Алькурая Х., Хан А.О., Аль-Оуайн М. и др.Аутозигомное секвенирование экзома у пациентов с дистрофией сетчатки выявляет патогенетические мутации и новые гены-кандидаты болезней. Геномные исследования. 2013. 23 (2): 236–47. pmid: 23105016; PubMed Central PMCID: PMC3561865.
29. 29. Алдахмеш М.А., Сафие Л.А., Алкурая Х., Аль-Раджи А., Шамселдин Х., Хашем М. и др. Молекулярная характеристика пигментного ретинита в Саудовской Аравии. Молекулярное зрение. 2009; 15: 2464–9. pmid: 19956407; PubMed Central PMCID: PMC2786884.
30. 30. Pena V, Liu S, Bujnicki JM, Luhrmann R, Wahl MC.Структура многочастичного домена белок-белкового взаимодействия в факторе сплайсинга prp8 и его связь с пигментным ретинитом. Молекулярная клетка. 2007. 25 (4): 615–24. pmid: 17317632.
31. 31. Maeder C, Kutach AK, Guthrie C. АТФ-зависимое раскручивание мяРНК U4 / U6 с помощью геликазы Brr2 требует C-конца Prp8. Структурная и молекулярная биология природы. 2009. 16 (1): 42–8. pmid: 116; PubMed Central PMCID: PMC2707180.
32. 32. Mozaffari-Jovin S, Santos KF, Hsiao HH, Will CL, Urlaub H, Wahl MC и др.Н-подобный домен РНКазы Prp8 ингибирует опосредованное Brr2 разворачивание мяРНК U4 / U6, блокируя загрузку Brr2 на мяРНК U4. Гены и развитие. 2012. 26 (21): 2422–34. pmid: 23124066; PubMed Central PMCID: PMC34

    .

33. 33. Zhang L, Shen J, Guarnieri MT, Heroux A, Yang K, Zhao R. Кристаллическая структура C-концевого домена фактора сплайсинга Prp8, несущего мутанты пигментного ретинита. Наука о протеине: публикация Белкового общества. 2007. 16 (6): 1024–31. pmid: 17473007; PubMed Central PMCID: PMC2206663.
34. 34. Mozaffari-Jovin S, Wandersleben T, Santos KF, Will CL, Luhrmann R, Wahl MC. Ингибирование РНК-геликазы Brr2 С-концевым хвостом сплайсосомного белка Prp8. Наука. 2013; 341 (6141): 80–4. pmid: 23704370.
35. 35. Бун Си-Джей, Клеверинг Б.Дж., Лерой Б.П., Хойнг С.Б., Кеунен Дж.Э., ден Холландер А.И. Спектр глазных фенотипов, вызванных мутациями в гене BEST1. Прогресс в исследованиях сетчатки и глаз. 2009. 28 (3): 187–205. pmid: 19375515.
36. 36.Макдональд И.М., Гудисева Х.В., Вильянуэва А., Греве М., Карузо Р., Айягари Р. Фенотип и генотип пациентов с аутосомно-рецессивной бестрофинопатией. Ophthalmic Genet. 2012; 33 (3): 123–9. pmid: 21809908.
37. 37. Дитрих К., Якоби Ф.К., Типпманн С., Шмид Р., Зреннер Э., Виссинджер Б. и др. Новая мутация гена RP1 (Lys778ter), связанная с аутосомно-доминантным пигментным ретинитом. Британский офтальмологический журнал. 2002. 86 (3): 328–32. pmid: 11864893; PubMed Central PMCID: PMC1771063.
38. 38. Audo I, Mohand-Said S, Dhaenens CM, Germain A, Orhan E, Antonio A и др. RP1 и аутосомно-доминантная палочко-конусная дистрофия: новые мутации, обзор опубликованных вариантов и корреляция генотип-фенотип. Человеческая мутация. 2012. 33 (1): 73–80. pmid: 22052604.
39. 39. Ян З., Чен Й., Лилло С., Чиен Дж., Ю З., Михаэлидес М. и др. Мутантный проминин 1, обнаруженный у пациентов с дегенерацией желтого пятна, нарушает морфогенез фоторецепторного диска у мышей. Журнал клинических исследований.2008. 118 (8): 2908–16. pmid: 18654668; PubMed Central PMCID: PMC2483685.
40. 40. Никопулос К., Авила-Фернандес А., Кортон М., Лопес-Молина М.И., Перес-Карро Р., Бонтаделли Л. и др. Идентификация двух новых мутаций в CDHR1 в родственных испанских семьях с аутосомно-рецессивной дистрофией сетчатки. Научные отчеты. 2015; 5: 13902. pmid: 26350383; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4642573.
41. 41. Лю С., Ли П., Дыбков О., Нотротт С., Хартмут К., Лурманн Р. и др.Связывание Nop домена Prp31 человека с платформой композитной РНК-белка в snRNP U4. Наука. 2007. 316 (5821): 115–20. pmid: 17412961.

Обзор компьютерных инструментов для анализа и интерпретации данных секвенирования всего экзома

Секвенирование всего экзома (WES) — это применение технологии следующего поколения для определения вариаций экзома, которая становится стандартным подходом к изучению генетических вариантов при заболеваниях . Понимание экзомов людей при разрешении единого основания позволяет идентифицировать действенные мутации для лечения и ведения болезни.Технологии WES сместили узкое место в производстве экспериментальных данных в пользу ресурсоемкого анализа данных на основе информатики. Новые вычислительные инструменты и методы были разработаны для анализа и интерпретации данных WES. Здесь мы рассмотрим некоторые из текущих инструментов, которые используются для анализа данных WES. Эти инструменты варьируются от выравнивания исходных данных секвенирования до связывания вариантов с действенными терапевтическими средствами. Обсуждаются сильные и слабые стороны каждого инструмента, чтобы помочь исследователям принимать более информативные решения по выбору лучших инструментов для анализа своих данных WES.

1. Введение

Последние достижения в технологиях секвенирования следующего поколения предоставляют революционные возможности для характеристики геномных ландшафтов людей с разрешением единой базы для выявления действенных мутаций для лечения и ведения болезней [1, 2]. Секвенирование всего экзома (WES) — это применение технологии следующего поколения для определения вариаций экзома, то есть всех кодирующих областей известных генов в геноме. Например, более 85% болезнетворных мутаций при менделевских заболеваниях обнаруживаются в экзоме, и WES обеспечивает беспристрастный подход к обнаружению этих вариантов в эпоху персонализированной и точной медицины.Технологии секвенирования нового поколения сместили узкое место в производстве экспериментальных данных в пользу ресурсоемкого анализа данных на основе информатики. Например, Консорциум агрегации экзомов (ExAC) собрал и повторно проанализировал данные WES для 60 706 неродственных особей из различных генетических исследований конкретных заболеваний и популяций [3]. Чтобы получить представление о WES, новые вычислительные алгоритмы и методы биоинформатики представляют собой критически важный компонент в современных биомедицинских исследованиях для анализа и интерпретации этих массивных наборов данных.

Геномные исследования, в которых используется WES, с годами расширились, и были разработаны новые методы биоинформатики и вычислительные инструменты, помогающие анализировать и интерпретировать эти данные (рис. 1). Большинство вычислительных инструментов WES сосредоточено на создании файла Variant Calling Format (VCF) из необработанных данных секвенирования. После того, как файлы VCF были сгенерированы, дальнейшие последующие анализы могут быть выполнены другими вычислительными методами. Поэтому в этом обзоре мы классифицировали методы и вычислительные инструменты биоинформатики на категории Pre-VCF и Post-VCF.Рабочие процессы Pre-VCF включают инструменты для согласования необработанных считываний секвенирования с эталонным геномом, обнаружения вариантов и аннотации. Рабочие процессы после VCF включают методы обнаружения соматических мутаций, анализа путей, изменения числа копий, идентификации INDEL и прогнозирования драйверов. В зависимости от характера гипотезы, помимо VCF, анализ может также включать методы, которые связывают варианты с клиническими данными, а также с потенциальными терапевтическими средствами (рис. 2).