Почему клемма окисляется: Окислились клеммы. Решение

Posted on by alexxlab
Posted in Разное

Содержание

Почему окисляются клеммы АКБ и что с этим делать?

По старинке


Раньше подход к окисленным клеммам был прост, как сюжет повести «Старик и море». Увидел окислы, содрал наждачкой, забил клеммник потуже, затянул его от души, а если совсем эстет – обмазал всё это солидолом. Потом потихонечку пришло понимание, что мазать клеммы солидолом – это моветон. В ход пошли другие смазки, часть из которых подходит для этого действительно лучше (а ведь было время, когда и солидол ещё надо было где-то добыть). 

К причинам этого безобразия отношение было простое: а куда деваться? Контактам положено окисляться, так что это такое неизбежное зло. Правда, особо продвинутые всё же справедливо отмечали, что стоит обратить внимание на то, какая клемма окисляется быстрее: плюсовая или минусовая. Исходя из этого наблюдения можно было сделать вывод о том, что всё-таки идёт не так. Если больше окисляется плюсовая клемма, налицо перезаряд аккумулятора, если минусовая – то недозаряд.

В первом случае виноват почти всегда реле-регулятор напряжения, во втором – генератор. Или тоже реле-регулятор, но тут надо разбираться. Потому что ещё может быть плохая «масса».

Саму батарею при этом слишком долго не разглядывали. Купить новую всё равно было сложно, так что в крайнем случае было проще найти аккумуляторщика в каком-нибудь АТП, который вырубил бы в москвичёвскую АКБ новые свинцовые пластины из аккумулятора от ЗИЛа. В таких обстоятельствах лучше было не знать, что в чрезмерном окислении контактов может быть виновата сама батарея. Иначе можно было вообще потерять сон.

Сейчас машины стали сложнее, системы зарядки и сами аккумуляторы тоже изменились, а клеммы до сих пор иногда окисляются. Отчасти то старое правило (плюс – перезаряд, минус – недозаряд) справедливо и сегодня, но поиск причин слишком интенсивного окисления всё-таки может занять много времени. Посмотрим, с чего начать и чем всё это закончить.

Руками и глазами

Как и пятьдесят лет назад, поиск неисправности следует начинать с элементарной уборки под капотом. Точнее, с чистки клемм и самой батареи. 

Чем чистить клеммы – вопрос немного религиозный. Кто-то советует делать это старинным способом: металлической щёткой и наждачкой. Конечно, если вокруг клемм уже построены трёхэтажные наслоения окислов, другого выхода нет. Придётся сносить все эти сооружения механическим способом. Главное, не перестараться и не сточить клеммы слишком сильно. Понятно, что некоторые надевают клеммник, а для надёжности ещё вкручивают между ним и изношенной клеммой саморез, но это всё-таки не совсем правильно. Таким способом контакт можно сделать ещё хуже, отчего окисляться эта система станет ещё быстрее. Так что сначала лучше попробовать какой-нибудь более щадящий метод. Например, с помощью тряпочки и содового раствора (на стакан воды хватит столовой ложки соды). И уж если сода не помогает, придётся браться за нож, наждачку и всё прочее, чем можно соскрести окислы. Главное при этом помнить, что не надо поливать АКБ бензином или какими-нибудь растворителями – можно сделать только хуже.

Затем можно приступать к очистке самой батареи. Грязи на ней быть не должно вообще. Мы уже как-то рассказывали, что такое ток утечки, и говорили о том, что грязный аккумулятор – первый шаг к саморазряду. Теперь добавлю: и к окисленным клеммам – тоже. Поэтому хорошенько его отмываем и проверяем две вещи.

Первая – это дренаж. Окислы появляются особенно сильно из-за того, что на поверхность батареи и на клеммы каким-то образом попадает слишком большое количество электролита. Одна из причин этого безобразия – забитый газоотвод. Давление внутри батареи повышается, пары электролиты готовы в буквальном смысле слова лезть в любую щель. И они лезут через пробки банок (если они есть), через небольшие щели около самих клемм. А если ситуацию совсем запустить или допустить сильный перезаряд, когда электролит начинает вовсю кипеть, газы могут сделать в корпусе батареи такие щели, которых быть вообще не должно. То есть может лопнуть корпус.

Поэтому проверяем вторую вещь – целостность корпуса. Разумеется, он должен быть целым.

Во время очистки батареи проще всего оценить структуру самого окисла. Если он счищается довольно легко, а сам по себе кажется рыхлым, то в первую очередь надо смотреть всё то, о чём говорил выше. Такой окисел говорит о том, что по какой-то причине на поверхности корпуса слишком много электролита. Если внешне батарея целая, а дренаж не забит, стоит подумать о том, что батарея слишком часто страдает перезарядом. В этом случае из-за кипения электролита и оседания его паров на корпусе АКБ будет такой же мягкий и рыхлый окисел. Тут, конечно, желательно взять в руки вольтметр и проверить напряжение на клеммах при работающем моторе и разной нагрузке (с выключенными потребителями и включенными). Вполне возможно, что напряжение будет завышенным, и тогда сначала нужно разбираться с этой проблемой. Решите её, и клеммы не будут так быстро зарастать окислами.

Если же напряжение оказывается в норме, нужно проверять саму батарею. Одна из причин перезаряда – разрушение одной из банок АКБ (чаще – простое замыкание). В этом случае в остальных банках электролит может кипеть, как при перезаряде, а клеммы в этом случае тоже будут зарастать окислами очень быстро.

Во всех вышеописанных случаях количество окислов действительно больше на плюсовой клемме. Белый или голубой мягкий и пушистый окисел в этом случае – ещё один повод проверить, не идёт ли перезаряд.

Теперь перейдём к другому виду окисла – зелёному и прочному. Тому, который счищается только наждачкой.

Чуть сложнее  

Зеленеет чаще минусовая клемма аккумулятора. Основная причина роста количества такого окисла – это плохой контакт. Правда, нужно сделать оговорку: слово «плохой» относительно контакта очень многозначно. Поэтому проверять тут придётся многое.

Начнём с элементарного: с проверки самой клеммы. Просто накинуть провод на клемму – это ещё не всё. Во-первых, клемма должна быть чистая, во-вторых, клеммник после установки надо затянуть. Если контакт на клемме будет недостаточно надёжным, скорость её окисления существенно увеличится из-за хронического перегрева и паразитных токов. Кроме того, тут могут возникать искры и электрическая дуга. Эти вещи разрушают клемму, делая контакт ещё хуже, а окисление – активнее.

И не стоит забывать о том, что сама батарея должна быть закреплена, а провода – надёжно зафиксированы, как этому и положено быть при заводской сборке. У нас почему-то принято после снятия и установки АКБ бросать её как придётся. Особенно если аккумулятор старый и его приходится часто таскать домой для подзарядки. Мол, чего лишнего крутить, если вечером всё равно тащить его домой и ставить на зарядку. Это очень большая ошибка. Лишняя вибрация клеммников делает плохой контакт ещё хуже, так что лениться не стоит. У ленивых автовладельцев окислы будут всегда.

Впрочем, у слишком усердных они тоже возможны, но по противоположной причине. Стучать по клемме молотком, а потом расшатывать её в попытках снять с АКБ – это очень вредная привычка, которая приводит к тому, о чём говорили выше: появляются микротрещины, через которые испаряется электролит. Особенно если руки сильные, а мозг слабый.

Если с клеммой всё хорошо, проверяем «массу». Слабый контакт «массы» может привести к практически таким же последствиям: перегрев провода и клеммы и как следствие – окисление клеммы. Особенно серьёзно нужно проверить силовой провод, если в машине стоят какие-то нештатные мощные потребители, которые могут перегружать проводку. Например, сабвуфер с усилителем. Можно даже пощупать провода: если они горячие, что-то идёт не так, и разбираться нужно именно с этой проблемой. Окисление клеммы в этом случае – лишь симптом, а не сама болезнь. А лечить нужно именно болезнь.

Последнее – это проверка генератора и напряжения на клеммах. Если будет обнаружен недозаряд, минусовая клемма в плотном окисле будет неизбежно.

«А напоследок я скажу… »

Очень важно понимать, что появление любых отложений на клеммах – это признак неисправности. Никаких окислов там быть не должно. И ладно, если причина возникает сама по себе, от возраста автомобиля или его износа. Бывает, что виноват в этом сам владелец автомобиля. Согласитесь, что некоторые вещи у нас никак не кажутся причиной сильного окисления. Например, неправильная концентрация электролита в обслуживаемой батарее, кривая установка «музыки», болтающийся провод «массы», немного дурящий генератор или его проскальзывающий ремень… 

Вроде бы мелочи, а всё это и приводит к тому, что на клеммах появляются эти безобразные белые, зелёные или синие наросты. Поэтому если после очистки клемм окислы появляются снова, в машине что-то не в порядке. И игнорировать этот звоночек от клемм не стоит. Можно в одно прекрасное утро не запустить мотор из-за севшего аккумулятора, а можно просто сжечь машину потихоньку плавящимся проводом. И это будет уже очень обидно. 

Клеммы на аккумуляторе окисляются, что делать ♥ AAuhadullin.ru

Как устранить проблему, если клеммы на аккумуляторе окислились…

Приветствую всех автолюбителей Рено Логан, а также читателей блога AAuhadullin.ru. Сегодня рассмотрим ситуацию, когда клеммы на аккумуляторе окисляются и как следует поступить для устранения проблемы.

Если у вашей аккумуляторной батарее окислились клеммы, то их можно зачистить шкурой, но, не прилагая больших усилий, так как клеммы выполнены из свинца, который легко снимается шкуркой. После нескольких зачисток окислений диаметр выводов батареи станет меньше и хомуты проводов не смогут их гарантированно обжать. Это отразится на плохом контакте цепи в целом, что вызовет подгорание в соединительных цепях электрооборудования.

Особенно «чувствителен» к окислению стартер двигателя, которому не хватает напряжения тока для работы из-за потерь на соединительных клеммах батареи, «благодаря» окислу. Например, напряжение полностью заряженной батареи 13.2В, а через окисленные соединения на стартер приходит половина этого напряжения, поэтому стартер не может произвести запуск двигателя. Одновременно начинают подгорать силовые болты во втягивающем реле стартера, что в дальнейшем приведет к его отказу и потребуется покупка запчасти.

Наилучший и самый действенный, а также безопасный для батареи способ очищения от окисления ее выводов, это промывка их раствором обычной пищевой соды с водой. Этим же раствором очищаются клеммы, их можно вообще опустить в содовый раствор и подержать некоторое время. Вы сразу увидите, что пошла реакция нейтрализации окисла. Емкостью для раствора может послужить любая обрезанная пластиковая бутылка.

После прочистки выводов аккумулятора, а также соединительных клемм выводы батареи нужно смазать любой консистентной смазкой, например Литол 24. Для того, чтобы в дальнейшем окисление вновь не появлялось на соединениях аккумулятора, для выводов нужно вырезать фетровые или войлочные шайбы и надеть на выводы батареи. Затем капнуть на них с масляного щупа несколько капель моторного масла или пропитать чистым содовым раствором и также добавить несколько капель моторного масла. Далее поставить и обжать гайки хомутов и также сверху смазать Литолом 24.Обычно после такой доработки окисление уже не появляется вновь.

Чистым содовым раствором протирается также поверхность аккумуляторной батареи, где собирается тонкий слой окисла…

Попутно следует отсоединить места крепления проводов «массы» с кузовом и двигателем автомобиля, также их промыть раствором соды или зачистить наждачной шкуркой. Наносим тонкий слой смазки, хорошо подойдёт Литол 24, надежно обжимаем соединения проводов.

См. Видео Youtub 1

См. Видео Youtub 2

А вы Логановоды, что делаете, когда клеммы на аккумуляторе окисляются?

Удачи и до скорых встреч на страницах блога AAuhadullin.ru!

Вам так же будет интересно:

Ареометр от аккумулятора Алка

Быстро запустил двигатель зимой

Антикоррозионные шайбы для клемм OXIPRO Стандарт

Окисление клемм автомобильного аккумулятора отрицательно влияет на срок его службы, ведет к повышенному износу систем заряда и старта автомобиля. Окислы вызывают повышенное сопротивление на клеммах. Аккумулятор быстро разряжается и испытывает повышенные нагрузки при пуске двигателя. Происходит его ускоренный износ. Аккумулятор, который должен служить пять–семь лет, выходит из строя уже через полтора–два года. Для того чтобы этого избежать, используйте шайбы для клемм OXIPRO.

Антикоррозионные шайбы для клемм аккумулятора OXIPRO “Стандарт” предназначены для профилактики коррозии на клеммах. Для максимальной эффективности шайбы изготовлены из 100% фетра и пропитаны специальным антикоррозионным составом. Отлично поглощают пары электролита на соединении корпус-клемма и защищают клеммы от окисления.  Результат – отсутствие окислов и правильная работа автомобильного аккумулятора.

Антикоррозионные шайбы для клемм аккумулятора OXIPRO “Стандарт” предназначены для защиты клемм стандартного размера: 19,5 мм (± 0,5 мм) — положительная клемма и 17,9 мм (± 0,5 мм)  — отрицательная. В абсолютном большинстве европейских, американских и азиатских автомобилей установлены батареи с именно такими полюсными выводам.

Шайбы для аккумулятора OXIPRO “Стандарт” легко использовать. Для максимальной эффективности:

  1. Влажной губкой или мягкой тканью (микрофибра, хлопок и т. д.) очистите корпус аккумулятора. Если аккумулятор уже ранее использовался, предварительно смочите губку или ткань в содовом растворе (2 столовых ложки соды на стакан воды). Дайте корпусу высохнуть или протрите его насухо.
  2. Хорошо почистите клеммы мягкой металлической щеткой или мелкой наждачной бумагой. Сделайте это даже если аккумулятор новый. На свинцовых клеммах присутствует коррозия, даже когда аккумулятор не используется.     
  3. Оденьте красную шайбу OXIPRO на положительную клемму (+), черную – на отрицательную (-).
  4. Установите аккумулятор в штатное место автомобиля. Соблюдая полярность, подсоедините силовые провода автомобиля и надежно закрепите их.

Желаем долгой работы аккумуляторной батареи вашего автомобиля!

 

 

Окисление и восстановление

Первоначальный взгляд на окисление и восстановление заключается в добавлении или удалении кислорода. Альтернативная точка зрения состоит в том, чтобы описать окисление как потерю электронов, а восстановление как получение электронов. Одним из примеров, в котором этот подход является ценным, является высокотемпературная реакция диоксида свинца.

2PbO 2 -> 2PbO + O 2

В этой реакции атомы свинца приобретают электрон (восстановление), а кислород теряет электроны (окисление).

Этот электронный взгляд на окисление и восстановление помогает вам справиться с тем фактом, что «окисление» может происходить даже при отсутствии кислорода! Определение окислительно-восстановительных реакций расширено и включает другие реакции с неметаллами, такими как хлор и бром. Например, реакция

Mg + Cl 2 -> Mg 2+ + 2Cl —

Магний теряет электроны и поэтому считается «окисленным», тогда как хлор приобретает электроны и, как говорят, восстанавливается.Еще один способ судить о том, что хлор уменьшился, — это то, что заряд на атомах стал более отрицательным или уменьшился.

Рассмотрение этой загрузки как «степени окисления» — еще один способ охарактеризовать окисление и восстановление.

Взгляд на окисление и восстановление как на потерю и усиление электронов, соответственно, особенно подходит для обсуждения реакций в электрохимических ячейках. Например, в цинк-медном элементе полураакции окисления и восстановления равны

.

Zn (s) -> Zn 2+ (водн.) + 2e —

«Полураакция» цинка классифицируется как окисление, поскольку он теряет электроны.Терминал, на котором происходит окисление, называется «анодом». Для аккумулятора это отрицательная клемма.
Медь «полуреакция» классифицируется как восстановительная, поскольку она приобретает электроны. Терминал, на котором происходит восстановление, называется «катодом». Для аккумулятора это положительный полюс.

Cu 2+ (водн.) + 2e — -> Cu (s)

КЛЕММА АККУМУЛЯТОРА СНОВА ОКИСЛЕНА: КАК РЕШИТЬ ПРОБЛЕМУ РАЗ И НАВСЕГДА — ОБЩЕСТВО

Содержимое:

Качество контакта на выводах автомобильного аккумулятора напрямую влияет на надежность запуска мотора.В случае окисления даже очень мощный заряд имеет все шансы не попасть в стартер автомобиля, а значит, двигатель не заведется. Как нетрудно догадаться, постоянное внимание и уход за терминалами позволит избежать подобных проблем. Тем не менее, я хотел бы раз и навсегда преодолеть вредное окисление.

Причины раннего окисления клемм

Это все по вине пары. / Фото: thma.info.

В большинстве случаев окисление клемм аккумулятора происходит из-за того, что пары от самого аккумулятора попадают в аккумулятор.Они бросаются в щель между выводами и оседают там в виде конденсата. Результатом этого процесса является развитие электромеханической коррозии. Постепенно металлические элементы аккумулятора покрываются белым или желтым налетом. Утечка паров, в свою очередь, происходит через миниатюрные трещинки, которые так или иначе появляются вокруг контактов. Чаще всего это наблюдается на батареях, которые использовались более одного года.

Мешает стартеру. / Фото: blgi.RU.

Кроме того, причиной образования микротрещин является еще и то, что при попытке снятия клеммы многие автомобилисты начинают ее расшатывать. Правильным действием будет совершать круговые движения. Также не используйте отвертку, пытаясь выбить плотно прилегающую клемму.

Однако, даже если вы все сделаете правильно, рано или поздно микротрещины все равно появятся. Это связано с тем, что второй важной причиной их образования является вибрация автомобиля, избежать которой (по понятным причинам) во время движения невозможно.

Как решить проблему стойкого окисления

Делаем прокладку. / Фото: ya.ru.

Разобравшись с причинами терминального окисления, перейдем к способу решения проблемы. Этот метод работает в тех случаях, когда контакты окисляются именно из-за микротрещин. Техника, скажем прямо, «дедовская». Он заключается в том, что для каждого терминала необходимо сделать по две площадки. Для их создания нужно использовать войлок.

А потом вот так. / Фото: ya.ru.

Каждая прокладка должна иметь отверстие в центре, чтобы ее можно было надеть на контакт. Перед использованием колодки следует тщательно смочить в моторном масле. После установки защитного элемента поверх него надевается клемма. Прокладка, пропитанная маслом, в свою очередь, поможет закрыть все микротрещины и защитит металлические элементы от поднимающихся паров.

Окисление Wacker-Tsuji

Окисление Wacker — это промышленный процесс, который позволяет синтез этаналя из этена палладиевым окислением с кислород.Медь служит сокатализатором окислительно-восстановительного потенциала.

Модификация лабораторных весов — окисление Ваккера-Цуджи — полезна для синтез различных кетонов.

Механизм окисления Ваккера-Цуджи

Механизм типичен для химического состава олефинов палладия, а вода служит источник кислорода; восстановленный палладий повторно окисляется Cu (II) и в конечном итоге кислородом воздуха.

Дж. Цудзи, «Палладиевые реагенты и катализаторы» , первое издание 2004 , Уайли, 29–35.

Недавняя литература


Открытие практического прямого O 2 -Coupled Wacker Окисление Pd [(-) — спартеином] Cl 2
C. N. Cornell, M. S. Sigman, Org. Lett. , 2006 , 8 , 4117-4120.


Окисление и дегидрирование концевых олефинов по типу Ваккера с использованием Молекулярный кислород как единственный окислитель без добавления лиганда
Y.-F. Ван, Ю.-Р. Гао, С. Мао, Ю.-Л. Чжан, Д.-Д. Го, З.-L. Ян, С.-Х. Го, Y.-Q. Wang, Org. Lett. , 2014 , 16 , 1610-1613.


Удобная и эффективная региоселективная оксифункционализация, катализируемая палладием. Терминальные олефины с использованием молекулярного кислорода в качестве единственного реоксиданта
Т. Мицудоме, Т. Уметани, Н. Носака, К. Мори, Т. Мизугаки, К. Эбитани, К. Канеда, Ангью. Chem. Int. Эд. , 2006 , 45 , 481-485.


Гипервалентный йод как конечный окислитель при окислении по типу Ваккера Конечные олефины в метилкетоны
D.A. Chaudhari, R.A. Fernandes, J. Org. Chem. , 2016 , г. 81 , 2113-2121.


Селективное окисление производных стирола до кетонов над Палладий (0) / углерод с перекисью водорода в качестве единственного окислителя
X. Xia, X. Gao, J. Xu, C. Hu, X. Peng, Synlett , 2017 , 28 , 607-610.


трет -бутилнитрит: Органический окислительно-восстановительный сокатализатор для аэробных условий Альдегид-селективное окисление Ваккера-Цуджи
X. -S. Нин, М.-М. Ван, Ч.-З. Яо, Х.-М. Чен, Ю.-Б. Канг, Орг. Lett. , 2016 , 18 , 2700-2703.


Эффективное и высокоальдегид-селективное окисление Wacker
П. Тео, З. К. Виккенс, Г. Донг, Р. Х. Граббс, Org. Lett. , 2012 , 14 , 3237-3239.


Общая и эффективная каталитическая система для окисления типа Ваккера с использованием ТБГФ как конечный окислитель: применение на классически сложных субстратах
B.В. Мишель, А. М. Камелио, К. Н. Корнелл, М. С. Сигман, J. Am. Chem. Soc. , 2009 , 131 , 6076-6077.


Бесследное ОН-направленное удаление окисления-удаления Wacker, альтернатива Wittig Олефинирование / конденсация альдолов: синтез α, β-ненасыщенных и Неконъюгированные кетоны из гомоаллиловых спиртов
V. Bethi, R. A. Fernandes, J. Org. Chem. , 2016 , 81 , 8577-8584.


Окисление внутренних алкенов по типу Ваккера с использованием Pd (Quinox) и TBHP
R. Дж. ДеЛука, Дж. Л. Эдвардс, Л. Д. Стеффенс, Б. В. Мишель, X. Цяо, К. Чжу, С. П. Кук, М. С. Сигман, J. Org. Chem. , 2013 , 78 , 1682–1683.


Катализатор-контролируемое окисление типа Wacker: легкий доступ к функционализированным Альдегиды
Z. K. Wickens, K. Skakuj, B. Morandi, R.H. Grubbs, J. Am. Chem. Soc. , 2014 , 136 , 890-893.


Многофункциональный палладиевый катализ. 2. Тандемное галоаллилирование с последующим Окисление Wacker-Tsuji или перекрестная связь Sonogashira
A.Н. Тадани, В. Х. Равал, Org. Lett. , 2002 , 4 , 4321-4323.


Многокаталитические процессы с использованием различных переходных металлов для синтеза of Alkenes
H. Lebel, V. Paquet, J. Am. Chem. Soc. , 2004 , 126 , 11152-11153.


Окисление алкинов по типу Ваккера до 1,2-дикетонов с использованием молекулярного кислорода
W. Ren, Y. Xia, S.-J. Цзи, Ю. Чжан, X. Ван, Дж. Чжао, Org. Lett. , 2009 , 11 , 1841-1844.


Внутримолекулярное Pd (II) -катализируемое аэробное окислительное аминирование алкенов: Синтез шестичленных N -гетероциклов
Z. Lu, S. S. Stahl, Org. Lett. , 2012 , 14 , 1234-1237.


Простой синтез 2-метилхинолинов с помощью Pd-катализируемого аза-вакера Окислительная циклизация
Z. Zhang, J. Tang, Z. Wang, Org. Lett. , 2008 , 10 , 173-175.

Свойства активного сайта окисленного и восстановленного С-концевого домена DsbD, полученные методом ЯМР-спектроскопии

Abstract

Периплазматический С-концевой домен белка DsbD Escherichia coli (cDsbD) имеет тиоредоксиновую складку.Два остатка цистеина в мотиве CXXC служат восстановителем для дисульфидной связи N-концевого домена, который, в свою очередь, может действовать как восстановитель для различных периплазматических партнеров. Образовавшаяся дисульфидная связь в cDsbD восстанавливается на через по неизвестному механизму трансмембранным спиральным доменом белка. Мы показали с помощью ЯМР-анализа 13 C, 15 N-меченых cDsbD, что белок является жестким, стабилен до крайних значений pH и претерпевает только локализованные конформационные изменения в непосредственной близости от мотива CXXC и в соседних областях вторичных структура, подвергаясь восстановлению / окислению.p K a были определены с помощью 2D ЯМР для N-концевого цистеина мотива CXXC, Cys461, а также для других остатков активного сайта. С помощью сайт-направленного мутагенеза продемонстрировано, что отрицательные заряды боковых цепей Asp455 и Glu468 в активном сайте вносят вклад в необычно высокое значение p K a , 10,5, для Cys461. Это значение выше, чем ожидалось, исходя из знаний о восстановительном потенциале cDsbD. В двойном мутанте cDsbD, D455N / E468Q, p K значение Cys461 снижено до 8. 6, значение, близкое к ожидаемому для невозмущенного остатка цистеина. Значение p K a второго цистеина в cDsbD дикого типа, Cys464, значительно выше, чем максимальное исследованное значение pH (pH 12,2).

Используемые сокращения

HSQC

гетероядерная одноквантовая корреляция

Ccm

цитохром c созревание

NOE

ядерный эффект Оверхаузера

cDsbD

C-концевой домен DsbD

C461A

cDsbD, содержащий мутацию

cDsbD, содержащую мутацию DsbD

C461A

cDsbD

, содержащую мутацию 9462 cDsbD.

E468Q

cDsbD, содержащий мутацию E468Q

D455N / E468Q

cDsbD, содержащий мутации D455N и E468Q

Ключевые слова

DsbD

ЯМР

cysteine ​​p

окись цистеина

9000 disteine ​​p k окт.

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

Полный текст

Copyright © 2007 Elsevier Ltd.Все права защищены.

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

ПОТОК ЭНЕРГИИ В МЕТАБОЛИЗМЕ

ПОТОК ЭНЕРГИИ В МЕТАБОЛИЗМЕ

ПОТОК ЭНЕРГИИ ПРИ МЕТАБОЛИЗМЕ

Энергия в метаболизме часто течет в виде электроны. Если электроны потеряны, это называется окисление . Если электронов, это называется редуктор . Окисление связано с редукция ; то есть, если что-то получится окисляется, затем восстанавливается что-то еще.

В большинстве случаев окисления и восстановления, которые мы будет изучать , электроны будут перемещаться с протоны (H +) . Наблюдая за атомами водорода таким образом, обеспечивает удобный способ определить, была ли молекула окисленные или восстановленные.

Кроме того, во многих окислительно-восстановительных реакциях мы посмотрите, молекула никотинамида аденин динуклеотида ( NAD ) будет служить электрон-челнок . NAD можно уменьшить на НАДх3 , а затем переносят электроны в другую реакцию и снова окисляются к NAD .В другом слов, НАД можно подобрать электроны из одной реакции и переносят их в другую.

Обратите внимание, что когда молекула окисляется, она теряет энергия. Кроме того, чем более восстановлена ​​молекула, тем больше у нее энергии. содержит. ( См. Стр. 110–111, рис. 5.9 и 5.10 для описания НАД и окислительно-восстановительного реакции. )

Конечная цель во многих случаях катаболизма будет забирать энергию из молекулы (источника пищи), улавливать энергию и сохраните его как СПС .

Есть три способа получить ATP:

1.) уровень субстрата фосфорилирование — где a высокоэнергетический фосфат на (источник пищи) молекула переносится непосредственно на ADP преобразовывая его в СПС .

2.) окислительный фосфорилирование — где молекула (источник пищи) окисленный , и энергия извлекается из электронов за счет переноса электронов цепь . Затем извлеченная энергия используется для сделать ATP с помощью процесса известный как хемиосмос .

3.) фотофосфорилирование — где световой энергии используется для генерации электронов , а затем энергия извлекается от электронов транспортом электронов цепь . Как и при окислительном фосфорилировании, извлеченная энергия используется для производства ATP по хемиосмос .

КАТАБОЛИЗМ ГЛЮКОЗЫ: ОБЗОР

(1.) GLYCOLYSIS — Embden Тропа Мейерхоф

( См. Стр.115 для получения подробной информации о путь. )

а. частичное окисление молекула глюкозы (6- молекула углерода) в 2 пировиноградных кислоты молекулы (3-углеродные молекулы).

г. использует 2 и ATP составляют 4 ATP

г. марки 2 НАДх3 

  (2.) БРОЖЕНИЕ  (См. Стр. 122-125 для  (3.) ДЫХАНИЕ  (См. Стр. 117 для
обсуждение и схемы обсуждения цикла Креба.Видеть
ферментация, стр. 6 для описания стр. 118-120 для обсуждения
хлеба на закваске.) цепь переноса электронов.)
а. Органическая молекула - это конечная а. последний акцептор электронов
акцептор электронов. Эти органические неорганические и процесс представляет собой
веществами являются такие вещи, как алкоголь и полное окисление глюкозы до
органические кислоты.  Это представляет собой СО2 и воду.
неполное окисление глюкозы.б. Анаэробный процесс. Не требует б. Процесс обычно аэробный.
кислород или любой другой неорганический электрон, в котором кислород служит неорганическим
акцептор. конечный акцептор электронов. Некоторый
                                         организмы способны к анаэробным
                                         дыхание с использованием других неорганических
                                         молекулы как конечный электрон
                                         акцепторы.c. Нет электронного транспорта. Без лимонной c. И цепь переноса электронов
кислотный цикл. и цикл лимонной кислоты работают в
                                         дыхание.
d. Небольшое количество продуцируемого АТФ - d. Производится много АТФ и НАДх3.
АТФ производится во время гликолиза.
е. Восстанавливает NAD из NADh3 так, чтобы e. NADh3 используется для производства АТФ.это
может происходить больший гликолиз, но это не означает, что НАД регенерируется. 
АТФ производится из НАДх3.

Что такое цепь переноса электронов?

Это серия ферментов, встроенных в мембрану. Эти ферменты используют мембрану для создания хемиосмотический градиент водорода Ионы . Этот градиент ионов водорода равен называется протонным мотивом силы , и эта сила поставляет энергию для ATP синтетаза .

Ферменты цепи переноса электронов представляют собой серию носитель окислительно-восстановительных электронов молекулы и протона насосы . Эти ферменты используют энергию в электронов, чтобы переместить протоны против градиента концентрации, чтобы сформировать Протонный мотив сила .

КЛАССИФИКАЦИЯ ОРГАНИЗМОВ ПО ПИТАНИЮ УЗОР:

ИСТОЧНИК ЭНЕРГИИ

свет — фототроф

окислительно-восстановительных реакций — хемотроф

ИСТОЧНИК УГЛЕРОДА

двуокись углерода — автотроф

органических соединений — гетеротроф

Анаэробное дыхание | Безграничная микробиология

Доноры и акцепторы электронов при анаэробном дыхании

При анаэробном дыхании молекула, отличная от кислорода, используется в качестве конечного акцептора электронов в цепи переноса электронов.

Цели обучения

Опишите различные типы акцепторов и доноров электронов, включая: нитрат, сульфат, гидроген, диоксид углерода и трехвалентное железо.

Основные выводы

Ключевые моменты
  • Как неорганические, так и органические соединения могут использоваться в качестве акцепторов электронов при анаэробном дыхании. Неорганические соединения включают сульфат (SO 4 2-), нитрат (NO 3 —) и трехвалентное железо (Fe 3+ ).Органические соединения включают ДМСО.
  • Эти молекулы имеют более низкий восстановительный потенциал, чем кислород. Следовательно, меньше энергии образуется на молекулу глюкозы в анаэробных условиях по сравнению с аэробными.
  • Восстановление некоторых неорганических соединений анаэробными микробами часто является экологически значимым.
Ключевые термины
  • анаэробный : без кислорода; особенно окружающей среды или организма.
  • восстановление : реакция, в которой приобретаются электроны и уменьшается валентность; часто путем удаления кислорода или добавления водорода.
  • анаэробное дыхание : метаболические реакции и процессы, происходящие в клетках организмов, использующих другие акцепторы электронов, кроме кислорода

Анаэробное дыхание — это образование АТФ без кислорода. Этот метод по-прежнему включает дыхательную цепь переноса электронов, но без использования кислорода в качестве конечного акцептора электронов. Вместо этого в качестве акцепторов электронов используются такие молекулы, как сульфат (SO 4 2-), нитрат (NO 3 —) или сера (S).Эти молекулы имеют более низкий восстановительный потенциал, чем кислород; таким образом, меньше энергии образуется на молекулу глюкозы в анаэробных условиях по сравнению с аэробными.

Анаэробное дыхание : Молекула, отличная от кислорода, используется в качестве конечного акцептора электронов при анаэробном дыхании.

Для анаэробного дыхания можно использовать много различных типов акцепторов электронов. Денитрификация — это использование нитрата (NO 3 — ) в качестве концевого акцептора электронов.Нитраты, как и кислород, обладают высоким восстановительным потенциалом. Этот процесс широко распространен и используется многими представителями Proteobacteria. Многие денитрифицирующие бактерии также могут использовать трехвалентное железо (Fe 3+ ) и различные органические акцепторы электронов.

При восстановлении сульфата в качестве акцептора электронов используется сульфат (SO 2 -4 ), в результате чего образуется сероводород (H 2 S) в качестве конечного продукта метаболизма. Восстановление сульфатов — это относительно энергетически слабый процесс, который используется многими грамотрицательными бактериями, обнаруженными в составе δ-протеобактерий.Он также используется у грамположительных организмов, связанных с Desulfotomaculum или археоном Archaeoglobus.

Восстановление сульфата требует использования доноров электронов, таких как соединения углерода лактат и пируват (органотрофные восстановители) или газообразный водород (литотрофные восстановители). Некоторые необычные автотрофные сульфатредуцирующие бактерии, такие как Desulfotignum phosphitoxidans, , могут использовать фосфит (HPO 3 — ) в качестве донора электронов. Другие, такие как определенные виды Desulfovibrio , способны к диспропорционированию серы (расщепление одного соединения на донор электронов и акцептор электронов) с использованием элементарной серы (S0), сульфита (SO 3 -2 ) и тиосульфата ( S 2 O 3 2-) для производства как сероводорода (H 2 S), так и сульфата (SO 2-).

Ацетогенез — это тип микробного метаболизма, при котором водород (H 2 ) используется в качестве донора электронов и диоксид углерода (CO 2 ) в качестве акцептора электронов для производства ацетата, тех же доноров и акцепторов электронов, которые используются в метаногенезе.

Трехвалентное железо (Fe 3+ ) — широко распространенный анаэробный терминальный акцептор электронов, используемый как автотрофными, так и гетеротрофными организмами. Электронный поток в этих организмах аналогичен потоку электронов, заканчивающемуся кислородом или нитратом, за исключением того, что в организмах, восстанавливающих трехвалентное железо, конечным ферментом в этой системе является редуктаза трехвалентного железа.Поскольку некоторые бактерии, восстанавливающие трехвалентное железо (, например, G. Metallireducens ), могут использовать токсичные углеводороды (, например, толуол) в качестве источника углерода, существует значительный интерес к использованию этих организмов в качестве агентов биоремедиации в водоносных горизонтах, загрязненных трехвалентным железом.

Другие неорганические акцепторы электронов включают восстановление иона марганца (Mn 4+ ) до марганца (Mn 2+ ), селената (SeO 4 2−) до селенита (SeO 3 2−). ) в селен (Se), арсенат (AsO 4 3-) в арсенит (AsO 3 3-) и уранил (UO 2 2+ ) в диоксид урана (UO 2 )

Органические соединения могут также использоваться в качестве акцепторов электронов при анаэробном дыхании.К ним относятся восстановление фумарата до сукцината, N-оксида триметиламина (ТМАО) до триметиламина (ТМА) и диметилсульфоксида (ДМСО) до диметилсульфида (ДМС).

Восстановление нитратов и денитрификация

Денитрификация — это тип анаэробного дыхания, при котором нитрат используется в качестве акцептора электронов.

Цели обучения

Описание процессов восстановления нитратов и денитрификации, а также организмов, которые их используют

Основные выводы

Ключевые моменты
  • Денитрификация обычно происходит путем поэтапного восстановления некоторой комбинации следующих промежуточных форм: NO 3 — → NO 2 — → NO + N 2 O → N 2 .
  • Обычно несколько видов бактерий участвуют в полном восстановлении нитрата до молекулярного азота, и в процессе восстановления было идентифицировано более одного ферментативного пути.
  • Полная денитрификация — это экологически значимый процесс, поскольку некоторые промежуточные продукты денитрификации (оксид азота и закись азота) являются значительными парниковыми газами, которые вступают в реакцию с солнечным светом и озоном с образованием азотной кислоты, компонента кислотных дождей.
Ключевые термины
  • акцептор электронов : акцептор электронов — это химическое соединение, которое принимает электроны, переданные ему от другого соединения.Это окислитель, который за счет акцептирования электронов сам восстанавливается в процессе.
  • эвтрофикация : процесс эвтрофирования.
  • факультативно : Необязательный; факультативный, дискреционный или факультативный

При анаэробном дыхании денитрификация использует нитрат (NO 3 — ) в качестве конечного акцептора электронов в дыхательной цепи переноса электронов. Денитрификация — широко используемый процесс; многие факультативные анаэробы используют денитрификацию, потому что нитраты, как и кислород, обладают высоким восстановительным потенциалом

Денитрификация — это микробиологический процесс, включающий ступенчатое восстановление нитрата до нитрита (NO 2 —) оксида азота (NO), закиси азота (N 2 O) и, в конечном итоге, до диазота (N 2 ) ферментами нитратредуктазы, нитритредуктазы, редуктазы оксида азота и редуктазы оксида азота.Полный процесс денитрификации можно выразить как окислительно-восстановительную реакцию: 2 NO 3− + 10 e — + 12 H + → N 2 + 6 H 2 O.

Протоны переносятся через мембрану исходной НАДН-редуктазой, хинонами и редуктазой закиси азота для создания электрохимического градиента, критического для дыхания. Некоторые организмы (например, E. coli ) продуцируют только нитратредуктазу и поэтому могут выполнять только первое восстановление, ведущее к накоплению нитрита. Другие (например, Paracoccus denitrificans или Pseudomonas stutzeri ) полностью восстанавливают нитраты. Полная денитрификация является экологически значимым процессом, поскольку некоторые промежуточные продукты денитрификации (оксид азота и закись азота) являются значительными парниковыми газами, которые вступают в реакцию с солнечным светом и озоном с образованием азотной кислоты, составляющей кислотных дождей. Денитрификация также важна при биологической очистке сточных вод, где ее можно использовать для уменьшения количества азота, выделяемого в окружающую среду, тем самым уменьшая эвтрофикацию.

Денитрификация происходит в особых условиях как в наземных, так и в морских экосистемах. Как правило, это происходит, когда кислород истощается, и бактерии вдыхают нитрат в качестве замещающего концевого акцептора электронов. Из-за высокой концентрации кислорода в нашей атмосфере денитрификация происходит только в анаэробных средах, где потребление кислорода превышает подачу кислорода и где присутствует достаточное количество нитратов. Эти среды могут включать определенные почвы и грунтовые воды, водно-болотные угодья, нефтяные резервуары, плохо вентилируемые уголки океана и отложения морского дна.

Роль почвенных бактерий в круговороте азота : Денитрификация — важный процесс в поддержании экосистем. Обычно денитрификация происходит в среде, обедненной кислородом.

Денитрификация выполняется в основном гетеротрофными бактериями (например, Paracoccus denitrificans ), хотя также были идентифицированы автотрофные денитрификаторы (например, Thiobacillus denitrificans ). Как правило, несколько видов бактерий участвуют в полном восстановлении нитрата до молекулярного азота, и в процессе восстановления было идентифицировано более одного ферментативного пути.

Rhizobia — почвенные бактерии с уникальной способностью устанавливать симбиоз N 2 -фиксации на корнях бобовых. Столкнувшись с нехваткой кислорода, около видов ризобий могут переключиться с O 2 -дыхания на использование нитратов для поддержки дыхания.

Прямое восстановление нитрата до аммония (диссимиляционное восстановление нитрата) может осуществляться организмами с геном nrf-. Это менее распространенный метод снижения содержания нитратов, чем денитрификация в большинстве экосистем.К другим генам, участвующим в денитрификации, относятся nir (нитритредуктаза) и nos (редуктаза закиси азота), которыми обладают такие организмы, как Alcaligenes faecalis , Alcaligenes xylosoxidans , Pseudomonas spp , Japdyansrihizobium .

Восстановление сульфатов и серы

Восстановление сульфата — это тип анаэробного дыхания, при котором сульфат используется в качестве конечного акцептора электронов в цепи переноса электронов.

Цели обучения

Описание процесса восстановления сульфатов и серы, включая его различные цели

Основные выводы

Ключевые моменты
  • Сульфатредукция — жизненно важный механизм для бактерий и архей, живущих в обедненных кислородом и богатых сульфатами средах.
  • Сульфатредукторы могут быть органотрофными с использованием соединений углерода, таких как лактат и пируват, в качестве доноров электронов, или литотрофными, и использовать газообразный водород (H 2 ) в качестве донора электронов.
  • Прежде чем сульфат можно будет использовать в качестве акцептора электронов, он должен быть активирован АТФ-сульфурилазой, которая использует АТФ и сульфат для создания аденозин-5′-фосфосульфата (APS).
  • Сульфатредуцирующие бактерии появились 3,5 миллиарда лет назад и считаются одними из самых старых форм микроорганизмов, внесших свой вклад в цикл серы вскоре после появления жизни на Земле.
  • Токсичный сероводород является одним из продуктов жизнедеятельности сульфатредуцирующих бактерий и источником запаха тухлых яиц.
  • Сульфатредуцирующие бактерии можно использовать для очистки загрязненных почв.
Ключевые термины
  • литотрофный : Получает электроны для дыхания от неорганических субстратов.
  • органотрофный : Получает электроны для дыхания от органических субстратов.

Восстановление сульфата — это тип анаэробного дыхания, при котором сульфат используется в качестве конечного акцептора электронов в цепи переноса электронов. По сравнению с аэробным дыханием, сульфатредукция является относительно энергетически слабым процессом, хотя это жизненно важный механизм для бактерий и архей, живущих в обедненной кислородом и богатой сульфатами окружающей среде.

Многие сульфатредукторы являются органотрофными с использованием углеродных соединений, таких как лактат и пируват (среди многих других) в качестве доноров электронов, в то время как другие являются литотрофными и используют газообразный водород (H 2 ) в качестве донора электронов. Некоторые необычные автотрофные сульфатредуцирующие бактерии (например, Desulfotignum phosphitoxidans ) могут использовать фосфит (HPO 3-) в качестве донора электронов, в то время как другие (например, Desulfovibrio sulfodismutans, Desulfocapsa thiozymogenes, и Desulfocapsa thiozymogenes) являются способный к диспропорционированию серы (разделение одного соединения на два разных соединения, в данном случае донор электронов и акцептор электронов) с использованием элементарной серы (S0), сульфита (SO 3 2-) и тиосульфата (S 2 O 3 2−) для производства как сероводорода (H 2 S), так и сульфата (SO 4 2−).

Прежде чем сульфат можно будет использовать в качестве акцептора электронов, он должен быть активирован. Это делается с помощью фермента АТФ-сульфурилазы, который использует АТФ и сульфат для создания аденозин-5′-фосфосульфата (APS). Впоследствии APS восстанавливается до сульфита и AMP. Затем сульфит восстанавливается до сульфида, а АМФ превращается в АДФ с использованием другой молекулы АТФ. Таким образом, весь процесс включает в себя вложение двух молекул энергоносителя АТФ, которые должны быть восстановлены после восстановления.

Все сульфатредуцирующие организмы — строгие анаэробы.Поскольку сульфат энергетически стабилен, он должен быть активирован аденилированием с образованием APS (аденозин-5′-фосфосульфат) с образованием APS, прежде чем он сможет метаболизироваться, тем самым потребляя ATP. Затем APS восстанавливается ферментом APS-редуктазой с образованием сульфита (SO 3 2-) и AMP. У организмов, которые используют соединения углерода в качестве доноров электронов, расход АТФ объясняется ферментацией углеродного субстрата. Водород, образующийся во время ферментации, на самом деле является движущей силой дыхания во время восстановления сульфата.

Сульфатредуцирующие бактерии появились 3,5 миллиарда лет назад и считаются одними из самых старых форм микроорганизмов, внесших свой вклад в цикл серы вскоре после появления на Земле жизни. Сульфатредуцирующие бактерии распространены в анаэробных средах (таких как морская вода, отложения и вода, богатая разлагающимся органическим материалом), где они способствуют разложению органических материалов. В этих анаэробных средах ферментирующие бактерии извлекают энергию из крупных органических молекул; образующиеся более мелкие соединения (такие как органические кислоты и спирты) дополнительно окисляются ацетогенами, метаногенами и конкурирующими сульфатредуцирующими бактериями.

Многие бактерии восстанавливают небольшое количество сульфатов для синтеза серосодержащих компонентов клеток; это называется восстановлением ассимиляционного сульфата. Напротив, сульфатредуцирующие бактерии восстанавливают сульфат в больших количествах для получения энергии и вытесняют образующийся сульфид как отходы; это известно как «диссимиляционное восстановление сульфата». «Большинство сульфатредуцирующих бактерий могут также восстанавливать другие окисленные неорганические соединения серы, такие как сульфит, тиосульфат или элементарная сера (которая восстанавливается до сульфида в виде сероводорода).

Токсичный сероводород — один из продуктов жизнедеятельности сульфатредуцирующих бактерий; его запах тухлых яиц часто является маркером присутствия в природе сульфатредуцирующих бактерий. Сульфатредуцирующие бактерии ответственны за сернистый запах солончаков и грязей. Большая часть сероводорода будет реагировать с ионами металлов в воде с образованием сульфидов металлов. Эти сульфиды металлов, такие как сульфид железа (FeS), нерастворимы и часто имеют черный или коричневый цвет, что приводит к темному цвету осадка.Таким образом, черный цвет ила на водоеме обусловлен сульфидами металлов, которые возникают в результате действия сульфатредуцирующих бактерий.

Черный ил : Черный цвет этого пруда обусловлен сульфидами металлов, которые возникают в результате действия сульфатредуцирующих бактерий.

Некоторые сульфатредуцирующие бактерии играют роль в анаэробном окислении метана (CH 4 + SO4 2- → HCO 3 — + HS– + H 2 O). Важная часть метана, образованного метаногенами ниже морского дна, окисляется сульфатредуцирующими бактериями в переходной зоне, отделяющей метаногенез от сульфатредукционной активности в отложениях.Этот процесс также считается основным стоком сульфатов в морских отложениях. В жидкостях гидроразрыва пласта, используемых для гидроразрыва сланцевых пластов с целью извлечения метана (сланцевый газ), в воду часто добавляют биоцидные соединения для подавления микробной активности сульфатредуцирующих бактерий, чтобы избежать анаэробного окисления метана и минимизировать потенциальные производственные потери.

Сульфатредуцирующие бактерии часто создают проблемы, когда металлические конструкции подвергаются воздействию сульфатсодержащей воды. Взаимодействие воды и металла создает слой молекулярного водорода на поверхности металла.Сульфатредуцирующие бактерии окисляют этот водород, образуя сероводород, который способствует коррозии. Сероводород из сульфатредуцирующих бактерий также играет роль в биогенной сульфидной коррозии бетона и вызывает закисление сырой нефти.

Сульфатредуцирующие бактерии могут использоваться для очистки загрязненных почв; некоторые виды способны восстанавливать углеводороды, такие как бензол, толуол, этилбензол и ксилол. Сульфатредуцирующие бактерии также могут быть средством борьбы с кислой шахтной водой.

Метаногенез

Метаногенез — это форма анаэробного дыхания, при котором в качестве акцептора электронов используется углерод, что приводит к образованию метана.

Цели обучения

Признать характеристики, связанные с метаногенезом

Основные выводы

Ключевые моменты
  • Двуокись углерода или уксусная кислота являются наиболее часто используемыми акцепторами электронов в метаногенезе.
  • Микробы, способные производить метан, называются метаногенами.Они были идентифицированы только из домена архей — группы, филогенетически отличной от эукариот и бактерий.
  • Производство метана — важная и широко распространенная форма микробного метаболизма. В большинстве сред это последний этап разложения биомассы.
  • Метан — один из основных парниковых газов. Средняя корова выделяет около 250 литров метана в день в результате расщепления целлюлозы метаногенами. Следовательно, крупномасштабное разведение крупного рогатого скота на мясо вносит значительный вклад в глобальное потепление.
Ключевые термины
  • метантиол : бесцветный газ, тиол с запахом тухлой капусты, естественным образом обнаруживаемый в растениях и животных.
  • кофактор : Вещество, особенно кофермент или металл, которое должно присутствовать для функционирования фермента.
  • ферментация : любая из многих анаэробных биохимических реакций, в которых фермент (или несколько ферментов, продуцируемых микроорганизмом) катализирует превращение одного вещества в другое; особенно преобразование (с использованием дрожжей) сахаров в спирт или уксусную кислоту с выделением диоксида углерода.

Метаногенез или биометанирование — это форма анаэробного дыхания, при которой в качестве концевого акцептора электронов используется углерод, что приводит к образованию метана. Углерод получают из небольшого числа низкомолекулярных органических соединений, таких как диоксид углерода, уксусная кислота, муравьиная кислота (формиат), метанол, метиламины, диметилсульфид и метантиол. Два наиболее описанных пути метаногенеза используют углекислый газ или уксусную кислоту в качестве концевого акцептора электронов:

Метаногенез ацетата : Ацетат расщепляется на метан в результате метаногенеза, типа анаэробного дыхания.

CO 2 + 4 H 2 → CH 4 + 2H 2 O

CH 3 COOH → CH 4 + CO 2

Биохимия метаногенеза относительно сложна. Он включает коферменты и кофакторы F420, кофермент B, кофермент M, метанофуран и метаноптерин.

Микробы, способные производить метан, называются метаногенами. Они были идентифицированы только из области архей — группы, филогенетически отличной от эукариот и бактерий, — хотя многие из них живут в тесной ассоциации с анаэробными бактериями.Производство метана — важная и широко распространенная форма микробного метаболизма, и в большинстве сред это последний этап разложения биомассы.

В процессе распада акцепторы электронов (например, кислород, трехвалентное железо, сульфат и нитрат) истощаются, в то время как водород (h3), диоксид углерода и легкие органические вещества, образующиеся в результате ферментации, накапливаются. На поздних стадиях органического распада все акцепторы электронов истощаются, за исключением диоксида углерода, который является продуктом большинства катаболических процессов.Он не обеднен, как другие потенциальные акцепторы электронов.

Только метаногенез и ферментация могут происходить в отсутствие акцепторов электронов, кроме углерода. Ферментация позволяет разрушать только более крупные органические соединения и производит небольшие органические соединения. Метаногенез эффективно удаляет полуфабрикаты продуктов распада: водород, мелкую органику и углекислый газ. Без метаногенеза большое количество углерода (в виде продуктов ферментации) накапливалось бы в анаэробной среде.

Метаногенез также происходит в кишечнике людей и других животных, особенно жвачных. В рубце анаэробные организмы, включая метаногены, переваривают целлюлозу в формы, пригодные для использования животным. Без этих микроорганизмов животные, такие как крупный рогатый скот, не смогли бы есть траву. Полезные продукты метаногенеза усваиваются кишечником. Метан выделяется из организма животного в основном при отрыжке (отрыжке). Средняя корова выделяет около 250 литров метана в день. Некоторые, но не все люди выделяют метан со своими газами!

Некоторые эксперименты даже предполагают, что ткани листьев живых растений выделяют метан, хотя другие исследования показывают, что сами растения на самом деле не производят метан; они просто поглощают метан из почвы, а затем выделяют его через ткани своих листьев.Возможно, до сих пор существует какой-то неизвестный механизм, с помощью которого растения производят метан, но это ни в коем случае нельзя утверждать.

Метан — один из самых важных парниковых газов на Земле, его потенциал глобального потепления в 25 раз выше, чем у углекислого газа (в среднем за 100 лет). Таким образом, метан, образующийся в результате метаногенеза в животноводстве, вносит значительный вклад в глобальное потепление.

Метаногенез также может быть полезен. Это основной путь разложения органических веществ на свалках (которые могут выделять большие объемы метана в атмосферу, если их не контролировать), и его можно использовать для обработки органических отходов и производства полезных соединений.Биогенный метан можно собирать и использовать в качестве устойчивой альтернативы ископаемому топливу.

Уменьшение протонов

При анаэробном дыхании используются сильно восстановленные частицы, такие как протонный градиент, для создания электрохимических мембранных градиентов.

Цели обучения

Обрисовать роль движущей силы протонов в метаболизме

Основные выводы

Ключевые моменты
  • При денитрификации протоны переносятся через мембрану исходной НАДН-редуктазой, хинонами и редуктазой закиси азота для создания электрохимического градиента, критического для дыхания.
  • Электрохимический градиент представляет собой одну из многих взаимозаменяемых форм потенциальной энергии, с помощью которой можно сохранять энергию. В биологических процессах направление движения иона за счет диффузии или активного транспорта через мембрану определяется электрохимическим градиентом.
  • В митохондриях и хлоропластах протонные градиенты используются для создания хемиосмотического потенциала, который также известен как протонная движущая сила.
Ключевые термины
  • фосфорилирование : процесс переноса фосфатной группы от донора к акцептору; часто катализируется ферментами

Градиенты протонов в восстановительном метаболизме

Биологическая энергия часто накапливается и высвобождается посредством окислительно-восстановительных реакций или передачи электронов.Восстановление происходит, когда окислитель приобретает электрон. Фотосинтез включает восстановление углекислого газа до сахаров и окисление воды до молекулярного кислорода. Обратная реакция, дыхание, окисляет сахара (теряет электрон) с образованием углекислого газа и воды. В качестве промежуточных этапов восстановленные соединения углерода используются для восстановления никотинамидадениндинуклеотида (НАД +), что затем способствует созданию протонного градиента. Затем это стимулирует синтез аденозинтрифосфата (АТФ) и поддерживается за счет снижения содержания кислорода или альтернативных рецепторов анаэробного дыхания.В клетках животных митохондрии выполняют аналогичные функции.

Основы окислительно-восстановительного потенциала : В каждой окислительно-восстановительной реакции есть две половины: восстановление и окисление.

Электрохимический градиент представляет собой одну из многих взаимозаменяемых форм потенциальной энергии, с помощью которой можно сохранять энергию. В биологических процессах направление движения иона за счет диффузии или активного транспорта через мембрану определяется электрохимическим градиентом. В митохондриях и хлоропластах протонные градиенты используются для создания хемиосмотического потенциала, который также известен как протонная движущая сила.Эта потенциальная энергия используется для синтеза АТФ путем фосфорилирования. Электрохимический градиент состоит из двух компонентов. Во-первых, электрический компонент вызван разностью зарядов на липидной мембране. Во-вторых, химический компонент вызван разной концентрацией ионов на мембране. Комбинация этих двух факторов определяет термодинамически благоприятное направление движения иона через мембрану. Электрохимическая разность потенциалов между двумя сторонами мембраны в митохондриях, хлоропластах, бактериях и других мембранных компартментах, которые участвуют в активном транспорте с участием протонных насосов, иногда называют хемиосмотическим потенциалом или протонной движущей силой.

У дышащих бактерий в физиологических условиях АТФ-синтаза, как правило, работает в противоположном направлении, создавая АТФ, используя протонную движущую силу, создаваемую цепью переноса электронов в качестве источника энергии. Общий процесс создания энергии таким образом называется окислительным фосфорилированием. Тот же процесс происходит в митохондриях, где АТФ-синтаза расположена во внутренней митохондриальной мембране, так что часть F1 прикрепляется к митохондриальному матриксу, где происходит синтез АТФ.

В клеточном дыхании (как аэробном, так и анаэробном) используются сильно восстановленные частицы, такие как NADH и FADh3, для создания электрохимического градиента (часто протонного градиента) через мембрану, что приводит к разнице электрического потенциала или концентрации ионов на мембране. Восстановленные виды окисляются рядом интегральных дыхательных мембранных белков с последовательно увеличивающимися потенциалами восстановления, конечным акцептором электронов является кислород (при аэробном дыхании) или другой вид (при анаэробном дыхании).Рассматриваемая мембрана — это внутренняя митохондриальная мембрана у эукариот и клеточная мембрана у прокариот. Движущая сила протона или pmf заставляет протоны спускаться по градиенту (через мембрану) через протонный канал АТФ-синтазы. Результирующий ток запускает синтез АТФ из АДФ и неорганического фосфата.

Восстановление протонов важно для создания электрохимических градиентов анаэробного дыхания. Например, при денитрификации протоны переносятся через мембрану исходной НАДН-редуктазой, хинонами и редуктазой закиси азота для создания электрохимического градиента, критического для дыхания.В организмах, которые используют водород в качестве источника энергии, водород окисляется мембраносвязанной гидрогеназой, вызывая перекачку протонов посредством переноса электронов к различным хинонам и цитохромам. Окисление серы — это двухэтапный процесс, который происходит потому, что энергетически сульфид является лучшим донором электронов, чем неорганическая сера или тиосульфат, что позволяет большему количеству протонов перемещаться через мембрану.

Напротив, ферментация не использует электрохимический градиент. Вместо этого он использует фосфорилирование только на уровне субстрата для производства АТФ.Акцептор электронов НАД + регенерируется из НАДН, образующегося на окислительных стадиях пути ферментации за счет восстановления окисленных соединений. Эти окисленные соединения часто образуются во время самого процесса ферментации, но также могут быть внешними. Например, у гомоферментативных молочнокислых бактерий НАДН, образующийся при окислении глицеральдегид-3-фосфата, окисляется обратно до НАД + за счет восстановления пирувата до молочной кислоты на более поздней стадии пути. В дрожжах ацетальдегид восстанавливается до этанола.

Аноксическое окисление углеводородов

Аноксическое окисление углеводородов можно использовать для разложения токсичных углеводородов, таких как сырая нефть, в анаэробных средах.

Цели обучения

Описать процесс бескислородного окисления углеводородов применительно к морской среде

Основные выводы

Ключевые моменты
  • Углеводороды — это органические соединения, полностью состоящие из водорода и углерода.
  • Большинство углеводородов естественным образом встречается в сырой нефти, где разложившиеся органические вещества содержат большое количество углерода и водорода.Сжигание углеводородов — основной источник энергии для нынешних цивилизаций.
  • Анаэробное окисление метана (АОМ) — это микробный процесс, который происходит в бескислородных морских отложениях. АОМ считается очень важным процессом, сокращающим выбросы метана (парникового газа) из океана в атмосферу до 90%.
Ключевые термины
  • метанотроф : способность метаболизировать метан как единственный источник углерода и энергии.
  • синтрофный : Когда один вид живет за счет продуктов другого вида.
  • бескислородный : Недостаток кислорода.

Углеводороды — это органические соединения, полностью состоящие из водорода и углерода. Большинство углеводородов естественным образом встречается в сырой нефти, где разложившиеся органические вещества содержат большое количество углерода и водорода. Сжигание углеводородов — основной источник энергии для нынешних цивилизаций.

Сырая нефть содержит ароматические соединения, токсичные для большинства форм жизни.Их выброс в окружающую среду в результате разливов человека и естественных просачиваний может иметь пагубные последствия. Морская среда особенно уязвима. Несмотря на свою токсичность, значительная часть сырой нефти, поступающей в морские системы, удаляется в результате разлагающей углеводороды деятельности микробных сообществ. Хотя когда-то считалось, что углеводородные соединения могут разлагаться только в присутствии кислорода, открытие анаэробных бактерий и путей разложения углеводородов показывает, что анаэробное разложение углеводородов происходит естественным образом.

Загрязненная почва : Микробы могут использоваться для разложения токсичных углеводородов в анаэробной среде.

Факультативный денитрифицирующий протеобактерий Aromatoleum aromaticum штамм EbN1 был первым, который был определен как анаэробный разложитель углеводородов с использованием толуола или этилбензола в качестве субстратов. Некоторые сульфатредуцирующие бактерии могут восстанавливать углеводороды, такие как бензол, толуол, этилбензол и ксилол, и использовались для очистки загрязненных почв.Геном восстанавливающих железо и разлагающих углеводороды видов Geobacter Metallireducens был недавно определен.

Анаэробное окисление метана (АОМ) — это микробный процесс, который происходит в бескислородных морских отложениях. Во время этого процесса углеводородный метан окисляется сульфатом в качестве концевого акцептора электронов: CH 4 + SO 4 2- → HCO 3- + HS — + H 2 O. полагают, что АОМ опосредуется синтрофной агрегацией метанотрофных архей и сульфатредуцирующих бактерий, хотя точные механизмы этой синтрофной связи все еще плохо изучены.АОМ считается очень важным процессом в сокращении выбросов метана (парникового газа) из океана в атмосферу. По оценкам, этим процессом анаэробно окисляется почти 90% всего метана, образующегося из морских отложений. Недавние исследования показали, что некоторые синтрофные пары способны окислять метан нитратом вместо сульфата.

Кристаллические структуры окисленной и восстановленной митохондриальной тиоредоксинредуктазы предоставляют молекулярные детали механизма реакции

Абстрактные

Тиоредоксинредуктаза (TrxR) — важный фермент, необходимый для эффективного поддержания клеточного окислительно-восстановительного гомеостаза, особенно в раковых клетках, чувствительных к активным формам кислорода.У млекопитающих разные изоферменты функционируют в цитозоле и митохондриях. Благодаря сложному механизму эти ферменты переносят восстанавливающие эквиваленты от НАДФН на связанный ФАД, а затем на дисульфид активного центра. В TrxR млекопитающих дитиол затем восстанавливает мобильный С-концевой селеноцистеин-содержащий тетрапептид противоположной субъединицы димера. После активации С-концевой окислительно-восстановительный центр восстанавливает дисульфидную связь в тиоредоксине. В этом отчете мы представляем структурные данные о митохондриальных TrxR, TrxR2 (также известных как TR3 и TxnRd2).Мышиный TrxR2, в котором существенный остаток селеноцистеина был заменен цистеином, был выделен в виде холофермента, содержащего FAD, и кристаллизован (2,6 Å; R = 22,2%; R бесплатно = 27,6%). Добавление НАДФН к кристаллам TrxR2 привело к изменению цвета, что указывает на восстановление дисульфида в активном центре и образование частиц, предположительно являющихся комплексом с переносом заряда флавин-тиолат. Исследование модели, связанной с NADP (H) (3.0 Å; R = 24,1%; R (свободный = 31,2%) указывает на то, что остаток тирозина в активном центре должен вращаться из своего исходного положения, чтобы складываться против никотинамидного кольца НАДФН, которое расположено рядом с изоаллоксазиновым кольцом FAD для облегчения переноса гидрида. Подробный анализ структурных данных в сочетании с моделью необычного C-концевого селененилсульфида предлагает молекулярные детали механизма реакции и подчеркивает эволюционную адаптацию среди редуктаз.

Тиоредоксины — основные клеточные протеин-дисульфидредуктазы, отвечающие за регуляцию множества биохимических процессов внутри клетки (1). Эти белки поддерживаются в восстановленном состоянии тиоредоксинредуктазами (TrxR), гомодимерными флавопротеинами, которые катализируют НАДФН-зависимое восстановление тиоредоксинов (2, 3).

Две формы TrxRs эволюционировали со связанными, но разными способами катализа (2–5).Низкий- M r TrxRs ( M r ≈ 35 кДа) обычно обнаруживаются у прокариот, архей, растений и низших эукариот, тогда как высокие — M r TrxRs ( M r ≈ 55 кДа) наблюдаются у высших эукариот. На сегодняшний день только зеленые водоросли Chlamydomonas reinhardtii содержат как низкий, так и высокий уровень M . r TrxR (6).

Общие черты катализа сохраняются как в низко-, так и при высоком уровне M r TrxR (2, 4). TrxR переносит восстанавливающие эквиваленты от НАДФН к связанному с ним FAD, что в конечном итоге приводит к восстановлению дисульфида активного центра. В низком — М r TrxRs, каталитический цикл требует большого конформационного изменения после активации дитиола (4, 7, 8). Высокий- M r TrxR, дитиол активного центра восстанавливает третий активный окислительно-восстановительный центр в высокомобильном С-конце противоположной субъединицы.Эта третья группа отвечает за восстановление дисульфидной связи в тиоредоксине. Его природа видоспецифична и варьируется от дисульфида C-X-X-X-X-C в Plasmodium falciparum (9) до вицинального дисульфида в Drosophila melanogaster (10) или вицинального селененилсульфида в TrxRs млекопитающих (11, 12).

В системах млекопитающих три изофермента с высоким — M r Было идентифицировано TrxR: цитозольный (TrxR1) (11, 12), митохондриальный (TrxR2) (13) и изофермент, высоко экспрессируемый в семенниках (14, 15).Направленное нарушение генов либо TrxR1 (16), либо TrxR2 (17) приводит к эмбриональному летальному фенотипу, а TrxR1 и TrxR2, по-видимому, обладают неизбыточными функциями (16-19). На нулевые эмбрионы TrxR1 в первую очередь влияет нарушенная клеточная пролиферация (16), тогда как нулевые эмбрионы TrxR2 страдают тяжелой анемией и неправильным развитием сердца (17). Варианты сплайсинга TrxR1 и TrxR2 также были идентифицированы, включая вариант, который д. Приводить к нацеливанию TrxR2 на цитозоль (20-24). Однако биологические последствия этих изменений еще не решены, и им будет полезно провести дополнительные биохимические и структурные характеристики ферментов.

Многочисленные биохимические и компьютерные исследования дополнили наше понимание каталитического механизма высокой концентрации M r TrxR (2–5, 15, 25–28). Восстановление фермента одним эквивалентом НАДФН приводит к нескольким двухэлектронным восстановленным видам (EH 2 ), с преобладающим комплексом переноса заряда тиолат-флавин. Добавление второго эквивалента НАДФН приводит к четырехэлектронному восстановлению фермента (EH 4 ), в котором, вероятно, восстановлены как дисульфид активного центра, так и селеносульфид-содержащий С-концевой хвост противоположной субъединицы.После восстановления до состояния EH 4 фермент катализирует дисульфидный обмен между активированным C-концевым хвостом и окисленным тиоредоксином. На сегодняшний день молекулярные детали обмена селененилсульфид / дисульфид не определены.

Недавно появилась первая рентгеновская структура высокого- M r TrxR, цитозольный TrxR1 крысы, был описан (29). Общая топология этого фермента аналогична топологии других пиридиннуклеотиддисульфид-оксидоредуктаз, особенно глутатионредуктаз (30–35), и согласуется с более ранними исследованиями моделирования высокой концентрации M . r TrxRs (15).Интересно, что все остатки глутатионредуктазы, ответственные за распознавание субстрата, структурно консервативны в rTrxR1, хотя rTrxR1 не может напрямую восстанавливать окисленный глутатион. Авторы (15) предположили, что мобильный селененилсульфид, содержащий С-концевой хвост, не только служит третьей окислительно-восстановительной группой, но также блокирует связывание окисленного глутатиона с ферментом. Кроме того, в конструкции подтверждено обязательное расположение «голова-к-хвосту» высокоскоростного автомобиля M . r TrxR, с редокс-активным C-концевым хвостом одной субъединицы, взаимодействующим с активным центром противоположной субъединицы (36, 37).К сожалению, наблюдаемая конформация С-концевого хвоста препятствовала прямому взаимодействию с дисульфидной / дитиоловой группой активного центра, предполагая, что должна существовать дополнительная каталитически компетентная структурная организация.

Для дальнейшего изучения механизмов ферментов TrxR млекопитающих мы определили структуру митохондриального TrxR. В этом отчете описаны структурные особенности мышиного FAD-содержащего TrxR2 в отсутствие и в присутствии NADPH. Конформационные изменения, сопровождающие связывание пиридиновых нуклеотидов и восстановление фермента, выявляются сравнительным исследованием этих двух структур.Сравнение митохондриальных и цитозольных изоферментов предполагает потенциальные различия в ферментативной активности и дает дополнительную информацию о каталитическом механизме высокой концентрации M . r TrxRs.

Материалы и методы

Сбор данных и определение структуры. Зрелый мышиный TrxR Sec-523-Cys (mTrxR2) был экспрессирован в Escherichia coli , очищен с помощью аффинной хроматографии и кристаллизован, как описано в вспомогательном тексте , который опубликован в качестве дополнительной информации на веб-сайте PNAS.Дифракционные данные для холофермента mTrxR2 и комплекса mTrxR2 – NADP (H) были собраны с использованием излучения, производимого рентгеновским генератором MicroMax-007 Rigaku (Токио), оснащенным конфокальной синей оптикой и изображением оси R IV ++ пластинчатая система. Кристаллы поддерживали в криогенных условиях с помощью системы охлаждения X-stream, и данные анализировали с помощью пакета программного обеспечения crystal clear (Molecular Structure, The Woodlands, TX) (38). Структура mTrxR2 со связанным с ним FAD была определена путем молекулярного замещения с использованием программного пакета системы кристаллографии и ЯМР (39) и TrxR1 крысы (1H6V) (29) в качестве поисковой молекулы (≈55% идентичности последовательностей).Однозначное решение было получено с исходным R 39,4% ( R бесплатно = 40,6%), после доработки твердого тела. Полученная информация о фазе дает легко интерпретируемую карту электронной плотности, содержащую значительную положительную плотность в активном центре фермента, соответствующую пропущенной молекуле FAD (не показана). Комплекс mTrxR2 – NADP (H) изоморфен структуре mTrxR2 – FAD, и тот же R бесплатно Тестовый набор (10%) использовался при уточнении каждой структуры.

Построение и уточнение модели. Модели были уточнены с использованием системы кристаллографии и ЯМР (39) и перестроены после каждого раунда уточнения с использованием программы o (40). Неоднозначные области карты электронной плотности были оценены с помощью 2 F или — ф c имитация отжига опускаемых карт. По мере того, как модель приближалась к завершению, связанные кофакторы и молекулы воды подчинялись надлежащим ограничениям на водородные связи с электронной плотностью> 1.0 σ на 2 F или — ф c Карта и 3.0 σ на F или — ф c карта также была включена. Геометрия модели контролировалась с помощью molprobity (41), а на рис. 1, 2, 3, 4, 5 были созданы с использованием программы chimera (Калифорнийский университет, Сан-Франциско) (42).

Инжир.1.

Лента представляет общую структуру холофермента mTrxR2. Субблок A показан темным цветом, а субблок B — светлым. Белок состоит из трех доменов: FAD-связывающего домена (желтый), NADP (H)-связывающего домена (зеленый) и интерфейсного домена (синий). Связанные молекулы FAD представлены как модели, заполняющие пространство, в которых атомы углерода окрашены в серый цвет, атомы азота — в синий цвет, атомы кислорода — в красный цвет, а атомы фосфора — в голубой цвет. Боковые цепи Cys-483 в каждой субъединице, расположенные на границе раздела димеров, показаны в моделях, заполняющих пространство, с атомами серы, окрашенными в желтый цвет (в центре).

Рис. 2.

Структура mTrxR2 в комплексе с НАДФ (H). Ленточное представление mTrxR2 показано в ориентации, аналогичной рис. 1. FAD и NADP (H) показаны как модели, заполняющие пространство, и окрашены в желтый и зеленый цвета соответственно. Лента окрашена в соответствии со средним B-фактором соответствующего остатка.Значения варьируются от 20 (темно-синий) до 100 (темно-красный) Å 2 со средним фактором B для модели 61,7 Å 2 (белый).

Рис. 3.

Разностная карта электронной плотности Фурье сайта связывания NADP (H). На стереодиаграмме показана карта разностей с контуром ≈3 σ, наложенная на окончательную модель mTrxR2 – NADP (H).Атомы углерода окрашены в зеленый цвет, атомы азота — в синий, атомы кислорода — в красный, а атомы фосфора — в голубой. Для сравнения также показана окончательная модель холофермента mTrxR2 (голубой цвет).

Рис. 4.

Сравнение активных сайтов mTrxR2 и rTrxR1.Модели mTrxR2 и rTrxR1 были наложены друг на друга и показаны в виде палочек с использованием цветовой схемы, описанной на фиг. 3. ( A ) Сайт связывания NADP (H). В mTrxR2 (зеленый) никотинамидное кольцо NADP (H) расположено над изоаллоксазиновым кольцом FAD, но это не наблюдается в rTrxR1 (синий), потому что его сайт связывания занят боковой цепью Tyr-200. ( B ) Область, смежная с парой дисульфид / дитиол активного центра. Боковые цепи аминокислот mTrxR2 помечены соответствующими остатками из rTrxR1, указанными в скобках.Звездочка обозначает аминокислотный остаток из противоположной субъединицы димера. Обратите внимание, что для FAD представлено только кольцо изоаллоксазина. Thr-368 из mTrxR2 и Thr-339 из rTrxR1 имеют почти идентичную конформацию и для ясности опущены.

Рис. 5.

Модель C-конца mTrxR2.Непрерывная плотность не наблюдалась для последних четырех остатков структуры mTrxR2 – NADP (H), что подтверждает ее высокоподвижную природу. Таким образом, остатки G521, C522, U523 и G524 были смоделированы в активный сайт. На стереодиаграмме атом селена окрашен в розовый цвет, атомы азота — в синий, атомы кислорода — в красный, а атомы серы — в желтый. Атомы углерода субъединицы A окрашены в зеленый цвет, а атомы углерода из субъединицы B — в синий цвет и обозначены звездочками. Смоделированные остатки отмечены красным.Для ясности представлены только никотинамидное кольцо NADP (H) и изоаллозаиновое кольцо FAD.

Моделирование C-терминального хвоста mTrxR2. С-концевой хвост mTrxR2 очень подвижен, что согласуется с его ролью в переносе восстанавливающих эквивалентов из глубины молекулы фермента на дисульфид активного центра тиоредоксина. Электронная плотность для обеих структур mTrxR2 была довольно низкой по сравнению с Thr-518.Однако слабая плотность остова для Val-519 и Thr-520 наблюдалась в комплексе mTrxR2-NADP (H) и предполагала ориентацию C-концевого хвоста mTrxR2. Вицинальные дисульфидные связи относительно редко встречаются в доступных белковых структурах, и подавляющее большинство обнаруживается в β-витках типа VIII (43). Чтобы смоделировать селененилсульфид в окисленном mTrxR2, мы использовали вицинальный дисульфидный поворотный мотив в метанолдегидрогеназе в качестве матрицы (44). Этот прототип-мотив позволил нам смоделировать относительные положения Gly-521, Cys-522, Sec-523 и Gly-524, а абсолютное расположение C-концевого хвоста было выполнено вручную, оптимизируя взаимодействия в активном сайте mTrxR2. и поддержание разумных геометрических ограничений.

Результаты и обсуждение

Определение структуры и качество модели. Структура мышиного TrxR2 была определена путем молекулярного замещения с использованием родственного цитозольного TrxR1 крысы в ​​качестве зонда (29). Была получена легко интерпретируемая карта электронной плотности, и плотность четко наблюдалась для связанной с белком молекулы FAD (данные не показаны). Чтобы проверить решение, была построена симулированная карта пропуска отжига, исключающая остатки в пределах 5 Å от предполагаемого сайта связывания FAD.Для FAD наблюдалась сильная положительная плотность, а также дополнительные атомы, исключенные из расчета карты, что указывает на правильный раствор молекулярной замены (рис. 6, который опубликован в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS).

Кристаллы

mTrxR2 относятся к пространственной группе I4 1 22 и содержат единственную субъединицу димерного фермента в асимметричной единице. Статистические данные для окончательной модели mTrxR2-FAD приведены в таблице 1. Анализ графика Рамачандрана с помощью molprobity (41) показал, что конечная модель имела 91% остатков в предпочтительной области и> 99% в разрешенной области.Модель имела общий B-фактор 57,2 Å 2 , что отражало высокое общее тепловое движение внутри кристалла. Двойная симметрия димерного фермента соответствует кристаллографической оси и содержит обширные межсубъединичные контакты (рис. 1). N-конец mTrxR2 и последние шесть остатков полипептидной цепи не наблюдаются на карте электронной плотности. Более того, три области модели, соответствующие остаткам 158–182, 282–307 и 321–340, обнаруживают значительное движение, что подтверждается последовательными B факторами> 80 Å 2 .Эти области обладали сходной подвижностью в структуре mTrxR2 в комплексе с NADP (H), как обсуждается ниже (рис. 2). Значительно меньше контактов упаковки кристаллов наблюдается на крайних участках NADP (H) и FAD-связывающих доменов, что может объяснить большее тепловое движение, наблюдаемое в этих областях. Хотя для этих открытых остатков существует значительная электронная плотность, точное расположение атомов следует оценивать с осторожностью.

Таблица 1.Статистика сбора и уточнения данных для структур mTrxR2

Общая структура. Структура mTrxR2 сравнима со структурой других пиридиннуклеотиддисульфидредуктаз (30–34). Как описано для rTrxR1 (29), TrxR млекопитающих состоит из трех доменов: FAD-связывающего домена (остатки mTrxR2 35–190, 322–392), NADPH-связывающего домена (mTrxR2 остатков 191–321) и интерфейсного домена. (остатки mTxrR2 393–524) (рис.1 и 2). Сравнение mTrxR2 с родственным rTrxR1 показывает, что два фермента имеют очень похожие структуры (среднеквадратичное отклонение для C α = 0,79 Å). Существенным различием является наличие открытой межсубъединичной дисульфидной связи между Cys-483 в двух субъединицах mTrxR2. Этот цистеин является высококонсервативным среди TrxRs млекопитающих и располагается около конца спирали (α11 в rTrxR1) в интерфейсном домене (Fig. 1). Невосстанавливающий SDS гель mTrxR2 указывает на то, что только ≈10% белка участвует в межсубъединичной дисульфидной связи (данные не показаны), предполагая, что условия кристаллизации могут способствовать образованию этой дисульфидной связи.Интересно, что соответствующий цистеин в rTrxR1, Cys-458, находится в аналогичном положении, но в восстановленном состоянии (29). Интересная возможность состоит в том, что Cys-483 представляет третью пару дитиол / дисульфид в ферменте с еще не идентифицированной функцией.

Сайт связывания НАДФН. Для идентификации сайта связывания кофактора в ферменте кристаллы холофермента mTrxR2 переносили в искусственный маточный раствор, содержащий НАДФН. Наблюдалось поразительное изменение цвета: желтые кристаллы mTrxR2 стали темно-красными (рис.7, который опубликован в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS), предполагая образование комплекса с переносом заряда с добавлением NADPH. В рамках предложенного каталитического механизма восстановление дисульфида активного центра приводит к образованию комплекса с переносом заряда между FAD и тиолатом активного центра (2, 4, 25–27). Важно отметить, что избыток НАДФН, добавленный к кристаллу, может замещать образующийся окисленный кофактор без разрушения комплекса с переносом заряда (25).Следовательно, мы не можем однозначно утверждать, связан ли NADP + или NADPH в активном сайте, и, таким образом, обозначить кофактор как NADP (H). Кроме того, чтобы учесть комплекс с переносом заряда, остатки цистеина в активном центре mTrxR2, Cys-86 и Cys-91 были смоделированы в восстановленном состоянии, так что сера Cys-91 находится в непосредственной близости от C4A флавиновое кольцо (≈3,4 Å).

Из-за среднего разрешения структуры (3,0 Å) изучение электронной плотности как таковой не может исключить возможность наличия дисульфида между Cys-86 и Cys-91.Однако моделирование дисульфидной связи между Cys-86 и Cys-91 в комплексе mTrxR2 – NADP (H) приводит к нескольким разностным пикам в соответствующей области F . или — ф c карта, предполагающая, что смоделированный дисульфид плохо согласуется с данными рентгеновского излучения (данные не показаны). Кроме того, сравнение холофермента mTrxR2 и комплекса mTrxR2-NADP (H) путем изучения разностной карты электронной плотности Фурье предполагает умеренные различия в размещении Cys-86 и Cys-91, согласующиеся с восстановлением дисульфида (данные не показаны). .Окончательная модель комплекса mTrxR2 – NADP (H) показана на рис. 2, а статистические данные модели представлены в таблице 1.

В целом структуры холофермента mTrxR2 – NADP (H) и mTrxR2 очень похожи, со среднеквадратичным отклонением для C α = 0,45 Å. Как и в случае с окисленной структурой mTrxR2, остатки на границе раздела димера и в ядре активного сайта обнаруживают значительно более низкие B-факторы, чем остатки на крайних краях FAD- и NADPH-связывающих доменов (Рис. 2).Эти высокомобильные области, по-видимому, не играют прямой роли в катализе и соответствуют более расходящимся областям с высоким содержанием M . r Первичная структура TrxR. Чтобы уменьшить смещение, вносимое прямым сравнением моделей холофермента mTrxR2 и mTrxR2 – NADP (H), была рассчитана карта разностной электронной плотности Фурье с использованием фаз из голофермента mTrxR2. Это F или — ф Карта o была использована для оценки структурных изменений mTrxR2 при добавлении НАДФН (рис.3). Непрерывная электронная плотность наблюдалась для кофактора NADP (H), хотя качество карты в области никотинамидного кольца было несколько ухудшено из-за размещения Tyr-228 в модели окисленного mTrxR2. Положение изоаллоксазиновых колец в каждом комплексе было почти идентичным, и обе кольцевые системы были по существу плоскими.

В структуре белка mTrxR2 – NADP (H) наблюдается несколько значительных смещений. Два остатка аргинина, Arg-249 и Arg-254, переориентируются для взаимодействия с 2′-фосфатной группой НАДФН и, вероятно, придают ферменту специфичность к НАДФН по сравнению с НАДН (29).Кроме того, гидроксильная группа Ser-227 должна регулироваться, чтобы позволить связывание одной из мостиковых фосфатных групп НАДФН. Последний, F или — ф Карта o указывает, что боковая цепь Tyr-228 должна вращаться для размещения NADPH. Таким образом, чтобы организовать это критическое каталитическое событие, Tyr-228, который обычно защищает флавиновое кольцо FAD от растворителя в отсутствие NADPH, должен репозиционироваться, чтобы складываться против никотинамидного кольца при связывании кофактора.Консервативный остаток тирозина в глутатионредуктазе человека, Tyr-197, как было показано, выполняет сравнимую функцию (34, 45–47).

Важность такого поворота консервативного остатка тирозина при связывании пиридинового нуклеотида иллюстрируется исследованием структуры rTrxR1 (29). Плотность никотинамидного кольца NADP + в окисленном комплексе rTrxR1 – NADP + не наблюдается. Эквивалентный остаток тирозина, Tyr-200, расположен для защиты флавинового кольца от растворителя (рис.4 А , синяя модель) и, таким образом, препятствует эффективному связыванию NADP + . Только аденозиновые части каждого кофактора имеют сходную ориентацию в структурах rTrxR1 и mTrxR2. Мостиковые фосфатные группы и никотинамид рибоза связанного rTrxR1 NADP + значительно смещены относительно соответствующих атомов в структуре mTrxR2 – NADP (H). Без переориентации консервативного остатка тирозина никотинамидные и изоаллоксазиновые кольца не могут укладываться в стопку в положении, необходимом для переноса гидрида.

Активный сайт mTrxR2. Общая архитектура активного сайта mTrxR2 сравнима с архитектурой rTrxR1 (рис. 4 B ) (29) и глутатионредуктазы человека (31, 34, 46). В комплексе mTrxR2-NADP (H) пара дисульфид / дитиол активного центра наблюдается в восстановленном состоянии, тогда как этот окислительно-восстановительный центр активного центра находится в окисленном состоянии как в голоферменте mTrxR2 (рис. 1), так и в Комплекс rTrxR1 – NADP + (рис.4 В ). Помимо функциональной группы дисульфида / дитиола в активном центре, пара гистидин-глутамат находится в сходной ориентации в этих ферментах (h597 * -E502 * в mTrxR2; звездочка обозначает аминокислоту из противоположной субъединицы). Исследования мутагенеза показали, что оба остатка цистеина, а также остаток гистидина в активном центре важны для эффективного катализа (27). Другие функциональные группы mTrxR2, которые обращены к активному сайту фермента, включают Lys-56, His-143, Glu-503 * и Lys-506 *.Glu-503 * и Lys-506 * образуют солевой мостик и могут стабилизировать размещение Glu-502 *. Такое взаимодействие отсутствует в человеческой глутатионредуктазе и rTrxR1, но другие сети водородных связей поддерживают третичную структуру в этой области. Эпсилон-аминогруппа Lys-56 расположена на ≈3,1 Å от ND1 His-143 и может способствовать позиционированию имидазольного кольца. Интересно, что остаток тирозина заменяет His-143 как в глутатионредуктазе человека (Tyr-114), так и в rTrxR1 (Tyr-116; фиг. 4 B ). ).Этот остаток тирозина участвует в катализе (47), как обсуждается ниже, и, таким образом, замена остатком гистидина может модулировать каталитическую активность mTrxR2 относительно этих гомологов.

Моделирование окислительно-восстановительного C-терминального хвоста. Молекулярные детали того, как восстанавливающие эквиваленты переносятся из пары дисульфид / дитиол глубоко внутри активного сайта, в мобильный С-концевой хвост, содержащий мотив Gly-Cys-Sec-Gly, и, в конечном итоге, в окисленный тиоредоксин, остаются нерешенными.В структуре цитозольного изофермента крысы (29) С-конец был расположен в такой конформации, что остаток селеноцистеина не мог взаимодействовать с дисульфидом / дитиолом активного центра, что позволяет предположить, что должна существовать альтернативная конформация для С-конца. В текущем исследовании C-концевой хвост mTrxR2 демонстрирует значительную конформационную гибкость, о чем свидетельствуют высокие B-факторы его остатков. Кроме того, последние четыре остатка не наблюдаются в электронной плотности.

Мотив Gly-Cys-Sec-Gly структуры mTrxR2-NADP (H) был смоделирован в активном центре фермента (рис.5). Подходящая матрица для селененилсульфида была идентифицирована, и С-конец фермента был помещен в активный сайт противоположной субъединицы, оптимизируя взаимодействия и минимизируя геометрические деформации. Возможные конформации были ограничены наблюдаемым положением остатков 518–520 в структуре mTrxR2 – NADP (H). Хотя дополнительные конформации, безусловно, возможны, учитывая высокоподвижную природу этой области белка (29), модель согласуется с несколькими линиями биохимических данных, как обсуждается ниже, и является разумной отправной точкой для биохимических исследований, направленных на выяснение точных данных. механизм действия фермента.Восьмичленная кольцевая структура селененилсульфида противопоставляется Cys-86 дисульфида / дитиола активного центра (рис. 5). Атом селена селеноцистеина 523 * расположен почти на равном расстоянии от серы Cys-86 и эпсилон-азота His-497 *. Точно так же сера Cys-522 * соседствует с эпсилон-азотом His-143. Наконец, карбоксилат Gly-524 * может взаимодействовать с положительно заряженной боковой цепью Lys-506 * (не показано).

Значение для катализа. Точный механизм обмена селененилсульфид / дисульфид еще не определен для TrxR млекопитающих, но исследования D. melanogaster (DmTrxR1) (26, 48, 49) и P. falciparum (27, 37, 50) high — М r TrxR обеспечивают значительный анализ. DmTrxR1 проявляет значительную гомологию последовательностей с TrxR млекопитающих, но не является селенопротеином (26, 48). Он демонстрирует характерные особенности катализа, описанные для содержащих селеноцистеин TrxR, но вместо этого имеет мотив Ser-Cys-Cys-Ser на своем С-конце.Bauer et al. (26) идентифицировали Cys-57 и Cys-490 * (эквивалентные Cys-86 и Sec-523 * в mTrxR2) как две тиоловые группы, участвующие в обмене дитиол / дисульфид (26). Аналогичным образом, исследования с использованием TrxR P. falciparum предположили, что Cys 540 * (сравнимый с Sec-523 * в mTrxR2) является С-концевым обменным тиолом (27). Представленная модель C-концевого хвоста mTrxR2 в активном центре фермента согласуется с Sec-523 *, взаимодействующим с дитиол / дисульфид в активном центре через Cys-86.После восстановления селененилсульфида образующийся селенолят, вероятно, атакует дисульфид окисленного тиоредоксина (29), хотя это еще не подтверждено экспериментально.

Такое расположение окислительно-восстановительного активного C-концевого хвоста предполагает наличие нескольких остатков активного центра, которые могут способствовать катализу (Fig. 5). Пара активного центра глутамат-гистидин консервативна в высоком M r TrxRs и, как полагают, способствует восстановлению селененилсульфида за счет стабилизации образующегося отрицательного заряда селенолята (28).Исследования мутагенеза с участием аналогичной пары глутамат-гистидин в P. falciparum TrxR показали, что этот гистидин необходим для эффективного катализа (27). В структуре mTrxR2, в которой смоделирован С-концевой селененилсульфид (рис. 5), эпсилон-азот His 497 * расположен почти на одинаковом расстоянии от серы Cys-86 и селена Sec-523 * и согласуется с His-497 * участвует в катализе.

Второй гистидин активного центра наблюдается в mTrxR2, который может способствовать катализу.Эпсилон-азот His-143 расположен на ≈3 Å от смоделированной серы Cys-522 *, и его имидазольное кольцо, по-видимому, ориентировано соседним остатком лизина, Lys-56 (рис. 5). Интересно, что His-143 заменен остатком тирозина в rTrxR1 (Tyr 116; рис. 4 B ) и глутатионредуктазы (Tyr-114). Исследования сайт-направленного мутагенеза, в которых Tyr-114 глутатионредуктазы был заменен остатком лейцина, показывают, что Tyr-114 действительно участвует в катализе (47).Мутант Y114L демонстрирует почти 7-кратное снижение удельной активности, и хотя Tyr-114 не требуется для катализа, он способствует ферментативной эффективности. Это наблюдение, в сочетании с предложенной моделью, предполагает, что His-143 может участвовать в механизме mTrxR2. Однако потребуются дополнительные сайт-ориентированный мутагенез и кинетические исследования, чтобы оценить точное влияние His-143 на катализ.

Предполагается, что тиоредоксин-связывающий сайт TrxR расположен в щели между FAD-связывающим доменом и димерным интерфейсным доменом, рядом с С-концом фермента (рис.1 и 2). При отсутствии высокой — М r Структура комплекса TrxR / тиоредоксин, исследования моделирования показали взаимодействия, которые опосредуют распознавание субстрата с помощью TrxR (15, 28, 29). Для rTrxR1 предполагается, что несколько боковых цепей аминокислот в области, состоящей из остатков 115–124 и С-концевого хвоста, взаимодействуют с тиоредоксином (29). Соответствующие области в mTrxR2 (остатки 142–151) имеют сходные структурные мотивы, но обнаруживают некоторую вариабельность последовательностей.Эти различия могут отражать разные остатки распознавания на соответствующих субстратах тиоредоксина. Однако без подробной структурной информации о белок-белковом комплексе по-прежнему трудно приписать функцию конкретным остаткам.

Заключение

Сравнение структур mTrxR2 в присутствии и в отсутствие НАДФН выявляет несколько структурных перестроек, которые происходят при связывании восстановленного пиридинового нуклеотида, и предполагают, что тирозиновый остаток в активном центре, Tyr-228, необходим для оптимального размещения никотинамидного кольца НАДФН. .Хотя mTrxR2 сохраняет общую топологию, наблюдаемую в цитозольном TrxR крыс, несколько ключевых остатков активного сайта были заменены. Эти замены, вероятно, влияют на ферментативную активность, но важность специфических остатков активного центра для каталитической эффективности должна быть оценена сайт-направленным мутагенезом и кинетическими исследованиями. Кроме того, был идентифицирован потенциальный регуляторный окислительно-восстановительный центр, который включает остатки Cys-483 на противоположных субъединицах. В совокупности эти идеи, полученные в результате изучения описанных кристаллических структур, помогут в разработке дальнейших механистических исследований высокопрочного металла M . r TrxRs.

Благодарности

Мы благодарим доктора Хидэаки Морияму и доктора Кохеи Хомму из основного центра структурной биологии Университета Небраски за их вклад в поддержание рентгеновских и вычислительных ресурсов, а также доктора Мелани А. Симпсон (Университет Небраски) за внимательное отношение к делу. обсуждения рукописи. Описанный проект был поддержан Национальными институтами здравоохранения грантами GM065204 (для V.N.G.) и P20 RR-17675, а также финансированием Небраской исследовательской инициативы Центра структурной биологии Небраски.

Сноски

  • ↵ † Кому должна быть адресована корреспонденция.

    No related posts.

Телефон с большой батареей самой: Xiaomi выпустила смартфон с самой большой батареей в семействе. Видео

Инструкция устройство зарядное кедр авто: Как правильно заряжать и технические характеристики

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *